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1、第四章生物学与分子生物学技术实践第二节分子生物学技术【课标要求】尝试 PCR（DNA 多聚酶链式反应）技术的基本操作和应用【学习目标】1、用某一 DNA 片段进行 PCR 扩增。2、通过尝试 PCR（DNA 多聚酶链式反应）技术的基本操作，体验 PCR 这一常规的分子生物学实验方法，理解 PCR 的原理，讨论 PCR 的应用。【学习过程】活动 1合作交流，回顾以下有关 DNA 的基本知识： 1、基本组成元素： ；2、基本组成单位： （由一分子 、一分子 、一分子 组成）3、脱氧核苷酸链的形成：通过形成 构成彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。4、DNA 的空间结构： DNA 分子是由两条 平行的（即
2、一条链为 35，另一条链为 53 ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构。脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在 ，构成基本骨架； 排列在链的内侧。两条链上的碱基通过 连结起来，形成碱基对。5、DNA 分子的特性：稳定性、多样性、特异性6、DNA 的复制：（1）概念：由一个 DNA 形成两个完全相同的 DNA 的过程；（2）时期： ；（3）场所： ；（4） 条件：模板 、原料 酶 、ATP；（5） 复制特点：从过程上看 ，从结果上看 ；1（6） 精确复制的原因：一是规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板，二是碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行（7） 复制的意义：DNA 分子通过复制使遗传信息从
3、亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。一、PCR 技术活动 2自主研习阅读教材，合作探讨，解决以下问题1、概念： 实验技术。2、原理:（1） 与细胞内的 DNA 复制的相同之处：都需要 、 、 、四种 ，都需要解链和链延伸。（2） 与细胞内的 DNA 复制的区别：体内解链是靠 ，体外解链是靠 ； 体内的引物是 ，体外的引物是 ；体内的 DNA 聚合酶需在常温下发挥功能，体外的 DNA 聚合酶耐 。3、结果：使原来的 DNA 按 进行 扩增。4、特点：对 DNA 的扩增快速、简便、灵敏和专一。【补充】DNA 复制需要引物的原因：DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 3端延伸 DN
4、A 链。PCR 技术的前提条件：待扩增的 DNA 片段 3端脱氧核苷酸序列要已知，以便与合成出 2 个与两条 3端脱氧核苷酸序列互补的引物。二、PCR 扩增的过程活动 3阅读 P84，讨论并回答下列问题： 1、反应需要的条件引物：两种 ；反应物：四种 DNA 聚合酶： ；模板 DNA；离子条件： 溶液体系：反应缓冲液22、反应步骤（1） 变性：在 94高温条件下作为模板的 ；（2） 退火（也叫复性）：反应体系的温度降至 55，使得引物与作为模板的单链 DNA 上特定部位相互配对、结合。【补充】当 PCR 反应体系的温度由变性后快速冷却到 50左右时，引物与模板结合，一般不考虑解开的两个DNA
5、模板链的重新结合，原因：a.模板DNA 比引物长得多而且复杂得多， 不易重新结合；b. 加入的引物量足够大而模板链数量少，引物与模板间碰撞的机会远远多于模板互补链间的碰撞。（3） 延伸：反应体系的温度回升到 72左右，在单链上 4 种 按照 原则连接在 之后，使引物链延伸，形成互补的 DNA 双链。3、PCR 的结果（1） PCR 的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也做模板参与反应，并且由引物延伸而成的 DNA 单链会与引物结合，进行 DNA 的延伸， 这样，DNA 聚合酶只能特定地复制处于 2 个引物之间的 DNA 序列，使这段固定长度的 DNA 序列呈指
6、数扩增。（2） PCR 一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目为 230。三、边做边学：目的 DNA 片段的体外扩增【设备及用具】1、PCR 仪：（1） 作用：自动调控 ，实现 DNA 的扩增。（2） 替代者：用 3 个恒温水浴锅代替，操作时按程序在 3 个水浴锅中来回转移 PCR 反应的微量离心管即可。2、微量离心管：总容积 0.5ml，实际是进行 PCR 反应的场所。3、自动取液器：用于定量转移 PCR 配方中的液体，其上的枪头要用一次换一次。【实验操作步骤】1、准备：按照 PCR 反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上32、移液：用自动取液器按照 PCR 反应体系配方
7、往微量离心管里面加入各种试剂3、混合过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁注意：离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢； 手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀4、离心：过程：将微量离心管放在离心机上,离心约 10s离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果 5、反应：将离心管放入 PCR 仪上，设置好 PCR 仪的循环程序【提醒】1、为避免外源 DNA 等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。2、所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存。3、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。4、EB 是一种
8、致癌物，在实验过程中要做好防护工作，如戴塑料膜防护手套；在紫外灯下观察要戴上专用护眼镜。5、扩增不成功的原因：漏加了 PCR 的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR 程序设置不当等。四、PCR 技术的应用1、医学上可用 PCR 技术分析人的血液，对细菌病毒感染进行早期诊断。2、对单细胞中的 DNA 进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备出无突变的 DNA 片段供遗传病患者基因治疗时使用。3、法学上利用 PCR 技术直接分析血迹、精液、唾液或其他生物标本，可作为鉴别犯罪嫌疑人是否为作案人的重要辅助工具，也可以作为进行亲子鉴定的手段之一。4、古生物学上可利用 PCR 技术分析几万
9、年前的生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙足迹。5、在农业生物技术中，可运用 PCR 技术检测目的基因是否已经导入目标生物等。4第二节分子生物学技术校本作业（）1.PCR 技术是现代分子生物学实验工作的基本方法之一，区别于细胞内的 DNA 复制，它利用的原理是什么A、DNA 的半保留复制B、碱基互补配对C、转录和翻译D、DNA 的热变性原理（）2多聚酶链式反应中，引物的作用是A、打开 DNA 的双链B、催化合成 DNA 子链C、提供模板D、使 DNA 聚合酶能够从引物的 3端开始复制（）3.使用 PCR 仪具体实验操作顺序应为设计好 PCR 仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管
10、中依次加入各组分进行 PCR 反应离心使反应液集中在离心管底部A、B、C、D、（）4在 PCR 反应中，所使用的 Tag 聚合酶具备的特点是A、耐高温B、耐强酸C、耐强碱D、最适温度为 37（）5下列操作过程的叙述中错误的是A、PCR 反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B、PCR 所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20保存C、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须熔化 D、PCR 所用的缓冲液和酶从冰箱拿出后，迅速熔化（）6PCR 仪实际上是一台自动调控温度的仪器，下列有关它调控不同温度的叙述中错误的是A、95，使 DNA 分
11、子变性，解开螺旋B、55，使 DNA 分子恢复双螺旋结构，恢复活性C、72，使 DNA 分子开始复制，延伸D、72，使 DNA 分子复双螺旋结构，恢复活性（ ）7多聚酶链式反应(PCR 技术)是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于 PCR 技术叙述不正确的是APCR 技术是在实验室中以少量 DNA 制备大量 DNA 的技术B反应中新合成的 DNA 又可以作为下一轮反应的模板CPCR 技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D应用 PCR 技术与探针杂交技术可以检测基
12、因突变5（）8PCR 过程与细胞内的 DNA 复制过程相比，主要有两点不同，它们是PCR 过程需要的引物是人工合成的单链DNA 或RNA PCR 过程不需要DNA 聚合酶 PCR 过程中 DNA 的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 PCR 过程中，DNA 不需要解旋，直接以双链 DNA 为模板进行复制ABCD9、近 10 年来，PCR 技术（聚合酶链式反应）成为分子生物学实验室的一种常规实验手段， 其原理是利用DNA 半保留复制，在试管中进行 DNA 的人工复制（如图一），在很短的时间内， 将 DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。解旋
13、加热至94游离核苷酸降温至55复制 双子G加热至72DNA 样品单链DNA 模板寡核苷酸引物与DNA 单链形成配对结构游离核苷酸连接到DNA 单链上2 个完整的链DNA 分图一图二（1） 加热使 DNA 双链打开，这一步是打开 键，在图二中的位置是标号 ， DNA 双链打开的过程称为 ，细胞中是在 酶的作用下进行的。（2） 当温度降低时，引物与模板末端结合，在 DNA 聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成 2 条 DNA 分子。此复制过程的原料是 ，在图二中是标号 所指的位置。图二中标号 1 和 2 所代表的物质名称分别是 和 。（3） “PCR”技术的必需条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还有三个条件，即： 液体环境、适宜的 和 。（4） 通过“PCR”技术使 DNA 分子大量复制，若将一个用 15N 标记的 DNA 分子放入试管中，以 14N 标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则 15N 标记的 DNA 分子占全部 DNA 总数的比例为 。6
