检测细胞中泛素的连接摘要：蛋白质泛素化对细胞很多不同的决定性功能有重要的作用尽管我们已经知道: 蛋白质和泛素接合的结果是他们被蛋白酶体降解最近这已明显特指蛋白质泛素化，特别是单一泛素化在细胞中起调控作用,和细胞内的蛋白质磷酸化作用相似最强大最灵敏的检测方法是凝胶电泳后免疫沉淀反应后的蛋白的抗泛素化免疫印迹抗体识别泛素化的蛋白现已可行，泛素化免疫印迹法已成为一种实用的方法在研究尤其是翻译后蛋白质的突变等等许多不同的方面在这里,我们详细描述它的步骤,为了确定一个特定的蛋白质是否很有可能别被泛素化或去泛素化,我们提出有关在抗泛素化免疫印迹法中避免困难的警告1、介绍：在最近几年，我们理解的泛素蛋白酶体通道已不仅仅是描述的“垃圾桶”或“降解机器” ，而是已经暗示蛋白质泛素化以及蛋白酶体的主要功能是完成细胞的基本生理功能代谢调节现在意识到泛素化是具有非常高的通用性和关键性的调节蛋白质改性的作用，这作用好比一个公司的执行官而不是搞卫生的工程师除了它在清理细胞中摺叠错误,突变,或化学损坏的蛋白质方面的重要作用,泛素结合参与不同类型的作用例如作为抗原表达、细胞周期调控、内吞作用、信号传导、细胞凋亡、DNA 损伤修复、转录调控、生育、调制染色质结构、甚至逆转录病毒传染性。
大部分蛋白质包括短周期和长周期的在某种程度上都容易受泛素化影响因此，这个过程恰恰能够被协调的结合起来通过小集团的 E2 泛素结合酶和至少五类的 E3 泛素连接酶，每一个都有独特结合域，由两个主要的去泛素化酶也就是泛素后处理酶和泛素 C-ter-minal 水解酶进行平衡详细的有关泛素化和去泛素实验的酶学在其他章节中因此，蛋白酶体通道应被视为一个极其复杂，多任务管理机制的重要细胞功能组织显然我们对蛋白质泛素化丰富多彩的功能的进一步认识，将会涉及到生物化学和细胞生物学的其他方面因为泛素化对细胞工作的正常进行有重要的作用，当事情出错，有严重的后果有缺陷的蛋白质泛素化在人类神经性疾病的发病机理中扮演着重要角色，例如帕金森氏症、阿兹海默症、亨廷顿症，在肌肉萎缩造成的恶病质，以及癌症中，例如致癌人乳头瘤病毒引起的宫颈癌和遗传 Hippel-Lindau 癌症综合症因此，研究蛋白质泛素化最终能鉴定出新的治疗策略，即利用与治疗这些和其他人类疾病这一章中，我们将提供详细的通过免疫印迹的方法（Western blotting）来测定蛋白质的泛素化,最初是由将近二十年前的 Haas 和 Bright 发明的。
如今，免疫印迹法由于它较高的特异性和灵敏度以及泛素化的蛋白质能被相对简单的检测出来仍然是测量蛋白质泛素化的首选技术2、材料2.1 样品处理1、TNESV 细胞溶解缓冲剂：50mM Tri-HCl， Ph7.5,1%v/v Nonidet P-40 detergent（润湿剂） , 2 mM EDTA,100 mM NaCl, 10 mM sodium orthovanadate（正钒酸钠，是一种常用的磷酸酯酶抑制剂）,再加 1 mM phenyl-methylsulfonyl fluoride（苯甲基磺酰氟） , 10 µg/mL of leupeptin（亮抑蛋白酶肽）, and 10 µg/mL of aprotinin （抑肽酶）or preprepared protease inhibitor （蛋白酶抑制剂）cocktail （混合物） tablets (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN).N-Acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal (ALLnL) (100 mM) or other inexpensive proteasome inhibitor（蛋白酶体抑制剂） 可以加入防止通过蛋白酶体的分解代谢后泛素化蛋白的减少 and 10 mM iodoacetamide（碘乙酰胺） or 10 mM N-ethylmaleimide（N 顺丁二烯酰胺亚胺） can be included to inactivate ubiquitin-cleaving isopeptidases (see Notes 1 and 2).2、PBS ：溶解 8.0 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.44 g of Na2HPO4,and 0.24 g of KH2PO4 于大约 800 mL 超纯水中, 用 Hcl 调节它的 PH 至 7.4，然后加水至1L。
3、Reducing 凝胶电泳上样缓冲液 : 100 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris-HCl, pH 6.8,10% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 10% (v/v) 丙三醇, 0.1% (w/v) (一小撮) 溴酚蓝染料. 在 37°C 水浴中加热 and 轻轻摇动以溶解 SDS.2.2 免疫沉淀反应1、抗体的选择：通过抗泛素（antiubiquitin）抗体来免疫共沉淀一种特定的泛素化蛋白是不切实际的，因为有丰富的自由的泛素分子在多数情况下，这种蛋白将自动免疫沉淀以及凝胶电泳后的免疫印迹技术将会用来探索一种抗泛素（antiubiquitin）抗体幸运的是，从商业资源方面现在大规模的从大量的不同物种中选择筛选单克隆抗体是可以的大多数用于我们实验室的抗泛素化（antiubiquitin）抗体是做的不错的2、抗体复原缓冲液：无菌的 PBS 包含 0.1%w/v 叠氮化钠做防腐剂，如果抗体不是已经溶解的话3、Protein A-coated Sepharose microbeads（ 琼脂糖蛋白 A）：rehydrate Protein A-immobilized Sepharose（再水化凝胶固定化蛋白质 A）CL-4B beads (1.5 g) (Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA)，在 50ml包含 1%（w/v）牛血清蛋白的 TNESV 缓冲液中封闭过夜，4 度保存并摇动保证小颗粒悬浮。
用离心机离心 beads 1000g 5min，然后用相同的缓冲液洗涤两次并且离心20ug 兔抗鼠免疫球蛋白加入到处理过的样品中让他们在 4 度下再次摇动反应 2 个小时最后用 TNESV 洗涤三次并 4 度下保存4、在共沉淀过程中，将混合物垂直安装在旋转器上2.3 凝胶电泳1、全尺寸的或微型凝胶电泳室和电力供应 2、10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳：mix 10 mL of 30% (w/v) 丙烯酰胺 0.8% (w/v)N, N’-methylene–bis-acrylamide mixture (ProtoGel, National Diagnostics, Atlanta, GA),7.5 mL of 1.5 M Tris 缓冲液, pH 8.8, 12.5 mL of water, 0.3 mL of 10% w/v SDS, 0.1 mLof 10 % (w/v) 过硫酸铵溶液, and 20 µL of N, N, N', N'-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), in this order. Precast gels arealso available from commercial suppliers (see Note 4).3、饱和正丁醇溶液4、Whatman3 毫米纸5、聚丙烯酰胺凝胶：mix 1.5 mL of 30% (w/v) acrylamide 0.8% (w/v) bis-acrylamide mixture, 2.5 mL of 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 6.0 mL of deionized water,0.1 mL of 10% (w/v) SDS, 0.1 mL of 10% (w/v) ammonium persulfate, and 8 µL of TEMED.6、laemmli 样品凝胶负载缓冲液： 80 mM Tri-HCl, adjusted to pH 6.8, 100 mM DTT,10% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol, with a small amount (a pinch) of bromphenol blueindicator dye (~0.2% w/v)7、Tris-glycine-SDS gel-running buffer: 25 mM Tris base, 192 mM glycine, 0.1% (w/v)SDS. Do not adjust the final pH, which should be approx 8.3.8、预染的蛋白质的标准：分子量标准都可以从多种不同类型的商业的供应商。
我们用预染的广泛蛋白的标准从 250 到 10kDa 明显的分子量2.4 泛素化蛋白质电泳后转移到膜1、垂直凝胶湿传递箱2、采用 PVDF 膜的选择3、Towbin 湿转移缓冲液: 25 mM Tris, 0.15% (w/v) SDS， 0.2 M 甘氨酸, and20% (v/v) 甲醇. 不用调节 pH. For an alternative transfer buffer that isuseful for transferring free ubiquitin, as well as ubiquitinated proteins, use CAPS buffer:25 mM cyclohexylaminopropanesulfonic acid, pH 10.0, and 20% (v/v) methanol.4、湿凝胶缓冲液：63 mM Tris base, pH 6.8, 2.3% (w/v) SDS, and 5% (v/v) 2-mercaptoethanol.2.5 泛素化蛋白质的高温活化1、蒸压或热板烧开水2、玻璃盘2.6 膜的封闭和探索泛素化蛋白的免疫印迹 1、封闭液：5% (w/v) 脱脂奶粉 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl,2.5 mM 磷酸氢二钠 EDTA with 0.1% (v/v) Tween-20 洗涤剂去污剂2、TNE 洗涤液： 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2.5 mM disodium EDTA, 50 mM NaClwith 0.05% (v/v) Tween-20 detergent3、抗体稀释液：2.5% (w/v) 脱脂奶粉 in TNE wash solution4、HRP 二抗可以来自几个商业生产厂家，记住 HRP 二抗必须与原抗体特异性结合。
5、Whatman 3 毫米纸（滤纸？）6、Luminol-based 化学发光免疫印迹发展工具包7、高质量胶片8、胶片暗盒9、漆黑的房间里,显影或一个自动开发者化学发光成像系统3、研究方法大多数的调查人员研究细胞内蛋白质泛素化都依靠抗泛素免疫印迹检测泛素蛋白结合物这里描述的免疫印迹的方法和变化都已经被修改，从最初的被Hass 和 Bright 描述的免疫化学的泛素结合，被 Wilkinson 进行改进，检测特定蛋白基质的泛素化的第一次免疫沉淀反应的完成是来源于细胞裂解物的目标泛素化蛋白通过使用抗体针对个别蛋白质研究另一种方法是（vector-generated）使用的表达载体产生抗原表位标记的泛素，例如：FLAG–ubiquitin, 血凝素-ubiquitin or even Myc-ubiquitin，他们都是通过抗体免疫共沉淀，能够有效地辨认出抗原表位标记的泛素-substrate complex免疫沉淀样品进行 SDS -聚丙。