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1、1 基因工程技术 2 Jackson Symons andBerg 1972 generatedfirstrecombinantDNAmoleculesCohenandBoyer 1973 producedfirstplasmidvectorcapableofbeingreplicatedwithinabacterialhostvectors carriersofforeignDNA TheNobelPrizeinChemistry1980 3 定义 基因工程 geneengineering 重组DNA技术 recombinantDNAtechnique 是指在各种酶的作用下 将细胞外的核酸片
2、断 目的基因 在体外与病毒 细菌或其它载体通过入工剪切 连接构成重组DNA分子 将其导入受体细胞并使之无性繁殖 称之为 克隆 和表达 这种有目的的应用分子克隆技术 人为的改造基因 改变生物的遗传性状的系列过程 总称为基因工程 4 基因克隆 genecloning 是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制 扩增的技术 基因表达 geneexpression 是指目的基因在受体细胞内表达 研究功能 5 应用 克隆感兴趣基因进行序列分析 研究其组织结构 转入原核表达载体 进行大规模蛋白质合成 生产多肽产品 转入真核表达载体 导入细胞 研究其功能 表达调控机制等 6 基因工程
3、基本步骤 7 基因工程流程示意图 8 构建重组分子 连接 原料 目的基因 研究对象载体 目的基因的运载工具工具酶 连接酶 限制性内切酶 9 目的基因片段来源 基因组DNAPCR方法扩增特定的目的基因片段 已知基因序列 已有其它表达或克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增 通过RT PCR方法得到目的基因cDNA人工合成基因片段 价钱昂贵 10 目的基因来源选择 取决于解决什么问题 基因功能研究 cDNA RT PCR 基因表达调控的研究 基因组DNA PCR 11 PCR 引入合适的酶切位点 一个 两个 加保护碱基 1 3个 加上想要的标签 如Flag Myc His HA 启始及终止密码子 高
4、保真聚合酶 HF Pfu Probest等 12 片断的回收与纯化 13 载体 载体 Vector 是目的基因的运载工具 其作用是将目的基因带入受体细胞中 并使目的基因扩增和表达 种类 按来源分 质粒载体 plasmidvector 噬菌体载体 phagevector 柯氏质粒载体 cosmidvector 病毒载体 virusvector 按作用分 克隆载体 cloningvector 表达载体 expressionvector 穿梭载体 shuttlevector 14 克隆载体 cloningvector 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体 一般具有较低的分子量 较高的拷贝数和松弛型
5、复制子 主要由细菌质粒或与其它质粒 噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建 PBR322 表达载体 expressionvector 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体 可将重组体DNA导入适合的受体细胞 使所载荷的目的基因能够复制 转录和翻译 pCDNA3 15 穿梭载体 shuttIevector 能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的复制原点或酵母菌的自主复制序列 ARS 它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达 主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移 16 质粒载体 具有复制起始点 这是质粒自我增殖的必要条件 具有较小的
6、分子量 较高的拷贝数 是一个松弛型的质粒 具有某种选择性标记以区别转化和非转化细胞 大多是一些抗菌素抗性基因 赋予受体细胞对某些抗生素的抗性 为转化子选择提供便利 Ampr Tetr 具有若干限制性内切酶单一识别位点 便于外源基因插入 是细菌染色体外能够自我复制的双链环状DNA分子 17 克隆载体 PBR322 特点 分子量小 4 3kb 便于操作 有两个抗性基因 便于转化子筛选 有几个常用的限制性内切酶的单一位点 分布在抗性基因上 7种位于四环素选择标记上 4种位于Amp抗性基因上 外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性 导致抗性基因插入失活 这种特性可用于区分重组和非重组分子 松弛性质粒 在
7、大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数 当细菌蛋白质合成停止时 它仍能继续复制 18 19 20 TA克隆 A A 21 TOPO TA 22 原核His tag pQE系列 Qiagen pET22 Novagen GST tag pGEX系列 Pharmacia 表达载体 带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件 如启动子等 这些调控元件应与宿主细胞相适应 23 pCDNA3系列 Invitrogen 真核表达载体 大多是穿梭载体 24 pFLAG CMV系列 Sigma 25 Tet On Tet OffExpressionSystems Tet Off pTet splice pTet PTEN
8、pTet TAKPSVneo 26 DNA分子的体外连接 方法 粘性末端 相同的粘性末端互相配对进行连接 27 两种情况 a 目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接 载体易自身环化 用碱性磷酸酶 能除掉DNA 5 端P基团 使5 端带一OH 处理载体 可防止载体自环化 b 目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接 可控制目的基因的插入方向 定向克隆 28 碱性磷酸酶处理 29 平头末端 1 增加连接酶的量 连接酶对平末端DNA的Km约高于粘性末端DNA100倍 2 在末端加上一个人工接头 内含有一定的限制性内切酶位点 经酶切处理产生粘性末端 然后与载体连接 如加上一个人工接头内含GAA
9、TTC序列 用EcoRI酶切 产生EcoRI粘性末端 30 31 加同聚物尾 载体与片段没有共同的粘性末端时 可直接通过末端转移酶分别接上poly dA 和poly dT 然后退火 直接转化 分子间空缺部分可以在宿主体内修复 同尾酶 xhoI SalI 其他方法 BglIIAGATCTTCTAGA BamHIGGATCCCCTAGG AGATCTTCTAGA GGATCCCCTAGG 32 连接策略 pCMV 33 选择连接位点 1 HindIII粘性末端载体自身环化 四环素失活 方向不确定 2 EcoRI SalI 定向 一般不会有载体自身环化 四环素失活 3 XbaI SalI 反向 不能
10、进行表达 四环素失活 4 目的基因片段 BglII SalI 载体 BamHI SalI反向 不能进行表达 四环素失活 5 NotI 修平SalI一个粘性末端 一个平端SmaI 修平 SalI正向连接 四环素失活PstI SacI 34 连接浓度 片段与载体连接机率 自身环化一般计算公式 粘性末端 载体片段含量 ng 载体长度 kb 1DNA片段含量 ng DNA片段长度 kb 3 5平末端1 5 10 35 连接反应 10ul体系 H2OBufferVectorInsertligase 4 14 过夜 连接反应条件连接酶的活性 DNA的纯度 载体与目的基因的比例 PH值7 2 7 8适宜 1
11、4 不高于16 过夜 36 连接酶 两种 DNA连接酶 连接双链中两条DNA链之间形成磷酸二酯键 封闭双螺旋骨架缺口 需要一条DNA链的3 末端具有游离的OH 另一条DNA链5 末端的磷酸基团 P 吸能反应 需ATP存在 也可做DNA修复 但不能连接两条单链DNA分子和环化的单链DNA分子 而且只能连接粘性末端 T4DNA连接酶 是从感染T4噬菌体的E coli中分离得到的一种连接酶 粘性末端 平末端 平末端上加人工接头 用途比DNA连接酶广泛 是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶 37 其他酶 末端修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶 terminaldeoxynucleotidyltrans
12、ferase 简称末端转移酶 在合适的反应系统中 这种酶使DNA片段平末端的3 OH加上同聚核苷酸 产生具有poly A 或poly T 或poly G 或poly C 的粘性末端 碱性磷酸酶根据DNA重组的需要 为防止两DNA片段末端之间连接 经常采用碱性磷酸酶处理 使DNA末端的5 P成为5 OH 目前采用的碱性磷酸酶有两种 即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶 BAP 和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶 CIP CIP的比活性比BAP高出10倍以上 而且对热敏感 便于加热使其失活 38 重组子导入受体细胞 把重组DNA导入受体细胞进行扩增 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞 原核 真核 及选
13、择适宜的转化或转染的方法 受体细胞的要求 必须具备使外源DNA进行复制的能力 提供复制所需的原料 而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征 这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定 39 重组子导入受体细胞 途径 转化 质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌 感受态菌 的过程转染 噬菌体 病毒 或以它作为载体构建的重组子主动或被动被导入细胞的过程 感染 以病毒为载体的重组子 在体外包装成具有感染力的病毒颗粒 通过感染受体细胞 然后整合到受体细胞基因组上 40 转化 受体细胞 大肠杆菌 基因工程中最常用的宿主细胞转化机理 细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变 转化
14、效率 只有很少比例的细胞有能力掺入质粒DNA转化时大约在1000个DNA分子中 只有一个DNA分子获得成功 一般每微克完整的pBR322DNA产生105 107转化细胞 41 感受态菌制备 感受态 细菌细胞处于一个容易吸收外源DNA状态 这种状态的细菌称为感受态菌 氯化钙法 氯化镁法 电转法 42 氯化钙法 原理 快速生长的细菌用低渗低浓 50 100mM 的氯化钙 CaCl2 处理 使细胞肿胀成球形加入质粒后 即于细胞表面形成抗DNAase的羟基 磷酸钙复合物经42 热休克后 复合物被细胞吸收 非选择性培养基上生长数小时 球状细胞复原开始增殖 抗生素基因表达 43 重组子的筛选 根据重组体的
15、表型筛选 抗性基因插入失活 生存或是毁灭 互补现象 蓝白斑筛选 LacZ 受体菌 编码 半乳糖苷酶羧基端 C端 片断 载体 编码 一半乳糖苷酶氨基端 N端 的 肽 44 插入失活 45 互补现象 蓝白斑筛选 46 42 90s 900ulLB 37 45min Protocol 3 1ml菌液 沉淀 0 5mlCaCl2 6000rpm5min 冰浴30min 6000rpm5min 沉淀 0 1mlCaCl2 10ul连接产物 6ulPBR322 阴性对照 A T A T 阳性对照 Amp Tet 冰浴30min 47 阳性克隆的鉴定 挑菌落 小抽质粒 电泳 菌落PCR 94 10min 3
16、0s 40s 1min72 8min4 hold X30 碱裂解法 48 碱裂解法 原理 pH值介于12 0 12 5范围内 线形的DNA和环状的质粒DNA变性 中间的氢键短裂 线状DNA变性后互相分开 而环状分子双螺旋主链骨架彼此盘绕 互补两条链紧密合在一起 变性处理的质粒DNA和染色体DNA通过致冷或恢复中性pH 开始复性 环状分子由于本身合在一起 所以复性迅速而准确 线状DNA变性时彼此分开 复性慢而不准确 互相之间聚集形成较大的网状结构 离心后 与变性蛋白质和RNA一道沉淀下来 上清液中留存下的主要是环状DNA分子和少量的可溶性蛋白质和部分的RNA 这些可溶性蛋白质和部分的RNA可通过苯酚抽提及RNA酶处理去除 49 试剂作用 溶液I 葡萄糖 Tris HCL EDTA 低渗 细胞变的脆弱而易于裂解 EDTA螯和金属离子 防止DNA降解 溶液II NaOH SDS NaOH使细胞裂解 释放出质粒DNA和染色体DNA 溶液III 醋酸钾 降低反应pH值 起中和作用 50 初步鉴定 51 后续 测序确定插入序列与基因bank报告完全一致检测外源基因有无整合宿主细胞 检测外源基因转录
