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1、2 测序技术的发展历程及最新技术的应用 2020年4月 测序技术的发展历程及最新技术的应用 本文关键词：技术，发展历程，最新 测序技术的发展历程及最新技术的应用 本文简介：摘要：通过DNA测序不仅可以更好地认识生命的本质,了解生物的差异性、进化及发展史,而且为重组DNA的研究提供了方向,在疾病诊断及基因分型方面具有非常重要的实用价值。首先从发现DNA是遗传物质开始,简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程,以及各自的优缺点和主要测序技术或平台;其次,重点介绍了 测序技术的发展历程及最新技术的应用 本文内容： 摘 要：通过DNA测序不仅可以更好地认识生命的本质, 了解生物的差异性、进化及发
2、展史, 而且为重组DNA的研究提供了方向, 在疾病诊断及基因分型方面具有非常重要的实用价值。首先从发现DNA是遗传物质开始, 简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程, 以及各自的优缺点和主要测序技术或平台;其次, 重点介绍了由PacBio公司开发的第三代测序典型技术单分子实时测序技术 (SMRT) 和ONT纳米孔测序技术的原理、方法和技术流程, 并总结了第三代测序技术的应用领域, 包括基因组重测序、do novo测序、转录组研究、甲基化检测、与疾病相关的结构变异检测, 以及流行病学中病毒准种分析等应用;再次, 比较了三代测序技术在转录组测序和表观遗传学研究中的技术优势, 第三代测序技术
3、在基因组重复区域或结构变异等研究领域具有非常明显的优势, 对多种疾病的研究意义重大, 已成为未来重要的精准诊断工具, 此外, 凭借对重要经济物种遗传信息的解析, 育种工作者通过建立基因与性状的关联, 对持有优良性状基因的个体进行人工选育, 大大缩短了育种年限;最后, 对第三代测序技术在医疗、农业、环境等领域的应用前景进行了展望。 关键词：第三代测序; 单分子测序; 长读长; 结构变异; Abstract：DNA sequencing not only helps us better to understand the nature of life, biological differences
4、, different biological evolutions and developmental history of organisms, but also provides direction for recombinant DNA research, and has very important practical value in disease diagnosis and genotyping.Firstly, from the discovery that DNA is a genetic material, we briefly review the entire deve
5、lopment process of the first, second and third generation sequencing technologies, their respective advantages and disadvantages, and the main sequencing technologies or platforms in each.Secondly, we focus on the third generation sequencing typical technology developed by PacBio, including single m
6、olecule Real time (SMRT) , Oxford Nanopore Technologies (ONT) , introduce the principles, methods and technical processes, and summarize the application areas of the third generation sequencing technology, including the genomic resequencing, do novo sequencing, transcriptome studies, methylation tes
7、ting, disease-related structural variation testing and the application of viral quasispecies analysis in epidemiology.Thirdly, the advantages of three generations of sequencing techniques in transcriptome sequencing and epigenetics are compared, the third generation sequencing technology has obvious
8、 advantages in research fields, such as genomic repeat regions or structural variations, and very meaningful for the study of various diseases, it is considered to be an important and accurate diagnostic tool in the future.In addition, breeders can artificially select individuals by establishing ass
9、ociations between genes and traits by analyzing the genetic information of important economic species, which greatly shortens the breeding period.Finally, we prospect the future application of the third generation sequencing technology in medicine, agriculture and environment. Keyword：the third gene
10、ration sequencing; single molecule sequencing; long reads; structural variations; 自1953年Watson和Crick提出DNA分子双螺旋结构以来, 对遗传信息的解码一直是生命科学工作者的追求, 很多研究者开始了对DNA测序技术的探索。1975年, Sanger发明链终止法, 正式开启了一代测序的时代。1990年, 人类基因组计划正式启动;2000年, 人类基因组草图绘制完成, 生命科学步入基因组学时代。DNA测序技术的发展为人类探索自身和其他生命的奥秘提供了可能, 同时, 基因组学时代的来临对DNA测序技术也提
11、出了更高的要求, 推动了DNA测序技术的不断进步。目前科学研究已进入了高通量测序时代, 从单一、局部的基因或基因片段的研究转变成了对整个基因组的研究, 在基因组从头测序和转录组测序中应用较广。近几年来, 以单分子实时测序为代表的第三代测序技术开始进入人们的视野, 该测序技术跨越了一、二代较短读长而直接对DNA单个分子进行测序的新一代测序平台应用日益广泛。作者简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程、各自的优缺点及主要测序技术或平台, 重点介绍了由PacBio公司开发的第三代测序典型技术原理、方法和技术流程, 并总结了第三代测序技术的应用领域, 对第三代测序技术在医疗、农业、环境等领域的应
12、用前景进行了展望。 1、 测序技术的发展历程 1.1、 一代测序 1975年, Sanger等在聚合酶作用下利用引物对模板DNA链的合成发明加减法对DNA进行测序1, 随后引入双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) , 正式形成双脱氧链终止法2, 该方法又被称为Sanger法, 后期很多测序技术都是基于该技术衍生的。1977年, Sanger报道了噬菌体X174的DNA序列3, 这是第一个被测序的基因组, 人类首次实现了对生物遗传信息的解码。同年, Maxam等4发明了化学降解法, 化学降解法不同于双脱氧链终止法, 对原DNA降解片段而非聚合酶合成片段进行测序, 避免了合成时引入的错误。但是化学降解
13、法过程操作繁琐, 对有毒化学品和放射性同位素接触较多, 逐渐被双脱氧链终止法替代5。化学降解法、双脱氧链终止法及其衍生的测序技术统称为一代测序技术, 其中以双脱氧链终止法应用最为广泛, 故概念上提及一代测序也常被认为是Sanger测序。 双脱氧链终止法操作简便, 获得了研究者的广泛认可, 基于双脱氧链终止原理衍生了很多DNA测序技术, 如利用荧光标记代替放射性标记、采用自动成像系统检测的荧光自动测序技术6。随着科技的进步, 一些实验室也对双脱氧链终止法的自动化进行了研究, 并进行了商业化, 代表性的自动化测序仪制造商如ABI和Pharmacia-Amersham公司7。其中, ABI公司的Sa
14、nger测序仪应用最为广泛, 该平台利用毛细管电泳技术和荧光标记技术实现自动化。人类基因组计划 (Human Genome Project) 的大部分测序工作就是通过ABI Prism 3700完成8, 现阶段, 研究者的Sanger测序需求大部分在ABI 3730系列平台上实现9。 以Sanger法为代表的一代测序技术测序读长长 (可达1 000 bp) , 准确率高 (可达99.999%) , 对生物学研究具有重要意义, 至今仍是基因测序的金标准。不可忽视的是, 一代测序的通量低、成本高, 限制了其大规模高通量的应用。 1.2、 二代测序 20世纪90年代, 在大规模基因组学发展需求下,
15、人们一直试图开发通量更高、成本更低的测序技术, 区分于以Sanger法为代表的一代测序技术, 后来发展的测序技术称为二代测序技术 (second-generation sequencing, SGS) 。二代测序技术诞生之初被称为下一代测序技术 (next-generation sequencing, NGS) , 发展势头迅猛, 其中以Roche公司的454技术, Illumina公司的Solexa、Hiseq技术, ABI公司的SoLiD技术, Helicos公司的HeliScope技术等为典型代表10。二代测序通量高, 成本大幅降低, 测序周期也大大缩短。 Roche公司的454技术是第一个商业化的二代测序平台, 初期被很多研究者使用, 454技术采用焦磷酸测序法, 可获得较长的测序读长 (可达400 bp) , 但是不能准确测量同聚物长度, 会引入插入和缺失错误。ABI公司的SoLiD技术利用连接酶法, 而非其他测序常用的聚合酶, 通过8碱基单链
