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1、题目：肾素血管紧张素系统免疫调节机制及其对肿瘤免疫的作用摘要：肿瘤通过免疫逃避机制引起T淋巴细胞凋亡和增生受抑，而组织肾素血管紧张素系统(RAS)对多种组织细胞的增生和凋亡有重要的调节作用。本课题从时间动力学角度，以T细胞激活诱导的凋亡（AICD）为重点，分析RAS在细胞免疫中的表达变化、RAS对细胞免疫的调节作用及其作用机制，随之初步探讨干预RAS抑制肿瘤细胞引起的T淋巴细胞AICD的可能性。为细胞免疫和肿瘤免疫的调节提供新的思路。研究意义肿瘤的发生、发展和消退取决于与机体免疫系统的相互作用，研究肿瘤免疫的机制和影响因素，对于明确肿瘤的发生，和发展合理的免疫治疗方案均有重要意义。本项目旨在对
2、于肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）这一调节包括细胞增生和凋亡等多种重要功能的系统，研究其免疫调节作用和机制，并初步研究RAS对于肿瘤免疫的作用。本项目的思路如图：机体对肿瘤的免疫反应主要是T细胞介导的细胞免疫反应，虽然多种肿瘤特异和肿瘤相关抗原已经分离鉴定，肿瘤免疫反应的先决条件已经具备，但在大多数情况下，机体对肿瘤的免疫反应是无效和微弱的。主要原因是肿瘤在与机体的对抗和选择过程中发展的免疫逃避和免疫抑制机制：1）肿瘤低表达MHC I，不表达MHC II和共刺激分子配基如B7; 2)肿瘤抗原的丧失和遮蔽；3)肿瘤分泌免疫抑制因子如TGF-beta
3、,IL-6和IL-10；4）肿瘤诱导免疫耐受；5）肿瘤或者通过表达FasL，直接杀伤激活的T淋巴细胞，或者通过重定向细胞免疫（TH1-TH2）、激活NK1.1+/CD3+细胞等机制间接诱导T淋巴细胞通过AICD凋亡。虽然肿瘤的免疫豁免机制复杂多样，最终结果是肿瘤特异性的T淋巴细胞的增生受抑和凋亡，从而导致对肿瘤的免疫无反应性1。调节T细胞的增生凋亡是调节肿瘤免疫的一个重要靶点。肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）是机体进化过程中高度保守的内分泌网络，其对血压和水钠储留调节的传统的生物学功能已为人们所熟知，但愈来愈多的研究表明RAS具有广泛的生物学功能
4、，而“组织”RAS在局部表达通过自分泌和旁分泌作用，对细胞分化、增殖和凋亡的调节作用成为研究热点2。RAS的促进增殖和凋亡的作用已在包括心肌细胞、神经细胞、嗜铬细胞、成纤维细胞以及多种上皮来源细胞如血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等细胞组织证实3。在细胞免疫中，T淋巴细胞已证实表达RAS的各组成成分，组织RAS起作用的先决条件已经具备；血管紧张素II促进小鼠脾细胞自发增殖和在混合淋巴细胞反应中增殖4，血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡, 在一些免疫介导的炎症中起保护作用5，提示RAS对T淋巴细胞的增生和凋亡这两种看起来截然相反的过程均有重要的促进作用。在
5、细胞免疫中，机体对免疫细胞的增生和凋亡的调节体现在克隆选择和时间动力学控制上。正常的免疫反应是一个多阶段的过程，在免疫反应中，T细胞通过抗原识别和TCR/CD3信号，通过JAK/STAT、calcineurin/NFAT、MAPK等多种信号传导途径，引起T淋巴细胞激活、增生和细胞因子分泌；同时，Fas/FasL，CTLA-4等表达增加，Bcl2/Bax、FLIP等凋亡抑制因子下调，凋3亡敏感性逐步增加，使激活的T细胞发生凋亡6。在细胞周期中，TCR/CD3信号引起细胞周期的进展和细胞激活增生，而进入G1A但不能通过G1/S调定点的细胞将通过AICD凋亡7。机体通过对信号传导通路和细胞周期的调控
6、，使细胞的表型和细胞因子分泌、关键细胞蛋白发生有序变化，从而实现免疫细胞增生和凋亡的精确调控，既保证免疫反应，又避免免疫反应过度，保持免疫稳态。(如图：)： RAS能通过多条信号传导通路发挥作用，在T淋巴细胞可能影响calcineurin/NFAT途径4。RAS信号传导与TCR/CD3信号的相互作用（拮抗和协同/相加）和其作用时T细胞所处的状态，将决定RAS调节凋亡和增生的方向。我们设想RAS对免疫的调节作用，不在于它能调节免疫细胞的增生还是凋亡，而在于RAS调节增生和凋亡作用是否和正常免疫反应的动力学相吻合，从而决定RAS起促进或抑制作用。当然，此设想过于简化，但是，从时间动力学角度，分析R
7、AS在细胞免疫反应的不同阶段，尤其是在细胞激活增生阶段和AICD凋亡阶段的作用，将对正确理解RAS免疫调节作用有重要意义。而最新研究血管紧张素II促进小鼠脾细胞自发增殖，和在混合淋巴细胞反应中增殖，血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡，提示RAS信号和正常的免疫反应CD3/TCR信号和时间动力学能起协同作用。本项目1）以人周围血T淋巴细胞为实验对象，以CD3/TCR信号刺激T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段为主，从时间动力学角度，力图从总体上把握RAS对细胞免疫的调节作用。2）重点分析RAS对T细胞AICD的调节作用，初步分析RA
8、S对肿瘤介导的T细胞AICD这一重要免疫逃避机制的调节作用。从动力学角度分析RAS对T淋巴细胞增生和凋亡的调节作用，有助于真正明确RAS的免疫调节作用和机制，从而为发展新的免疫调节手段开辟途径。由于包括胃癌和肝癌等多种肿瘤组织低表达或不表达RAS8,多种成熟的和高特异性的RAS干预手段和药物的存在，预示着调节RAS在调节肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗方面的广泛前景。国内外的研究现状RAS在心肌细胞、血管内皮细胞和肺泡上皮细胞等多种组织和细胞的增生和凋亡调节作用及其信号传导通路已进行了深入研究，证明RAS对细胞增生和凋亡起重要调节作用。近两年来RAS对免疫的调节作用逐渐引起重视，目前已经证明：1）T细胞
9、和巨噬细胞表达RAS各组成成分；2）血管紧张素II能通过AT1受体促进T细胞增殖 ，敲除小鼠AT1受体能阻断ANGII的作用；3）血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡；4）血管紧张素转化酶抑制剂对免疫性炎症有保护作用; 5)RAS参与T细胞的calcineurin/NFAT信号传导通路。但尚有几个关键问题没有解决：1）大多数实验结果来源于动物实验；2）大部分研究局限于血管紧张素转化酶抑制剂，而未对RAS进行系统性的研究。3）虽然提示RAS对T细胞的增生凋亡均有促进作用，但未阐明RAS如何调节淋巴细胞增生和凋亡这两种看起来相反的作用，以及RAS对细胞免
10、疫调节的最终效果；4）未阐明RAS调节淋巴细胞功能的信号传导通路和细胞周期的调控机制。RAS在肿瘤免疫方面的研究国内外尚是空白。 3 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标1） 检测RAS各组成成分在淋巴细胞的mRNA和蛋白表达。2） 从时间动力学角度，以T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段为主，在免疫反应的包括：静止-激活（细胞因子分泌）-增生/分化-免疫下调（细胞凋亡和记忆细胞形成）过程中的不同阶段，分析 RAS的表达变化，分析RAS对T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡（AICD）的影响。3） 探讨RAS对T淋巴细胞AICD调节作用的细胞信号传导机制。
11、4） 检测RAS在肿瘤细胞中的表达，初步探讨RAS对肿瘤介导的T细胞AICD这一重要免疫逃避机制的调节作用。研究内容1） 收集健康志愿者新鲜周围血PBMC，采用CD3单克隆抗体刺激T细胞，辅以IL-2，制作T细胞多克隆激活免疫反应和AICD的模型。根据T细胞的表型（phenotype：包括细胞因子分泌情况和表面分子marker的表达）对免疫反应进行分期。2） 分析 RAS对于T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡的影响，明确RAS免疫调节作用的时间动力学。在T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段：a) 定性和定量测定RAS组成成分（血管紧张素原、AngII和AT1受体）的表达及其变化情
12、况。b) 采用AngII、ACEI(包括Captopril和Enalapril)和AT1受体特异阻断剂（Losartan）在不同层次上对RAS进行干预，分析 RAS对于T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡的影响。3） 从细胞信号传导机制明确RAS的对T细胞凋亡和AICD的调节机制。检测T细胞两条主要凋亡通路的关键信号传导分子：Bcl-2(线粒体/细胞色素C凋亡途径)，FLIP（AICD，Fas/FasL介导的细胞凋亡途径），分析RAS调节何种T细胞凋亡通路，及其在传导通路上的调节作用点。4） 收集同一肿瘤患者的PBMC和肿瘤切除标本中的肿瘤细胞并培养，定性定量测定肿瘤细胞的RAS组成成分表达。制作M
13、HC限制的肿瘤细胞免疫抑制和肿瘤诱导T细胞AICD模型，分析RAS对肿瘤诱导T细胞AICD的调节作用。拟解决的关键问题：1） 明确RAS在免疫反应不同阶段的作用，在免疫反应过程中的免疫调节作用的动力学，以及RAS免疫调节作用的综合效果。2） 明确RAS对T细胞AICD调节作用的细胞信号传导机制。3） 制作MHC限制的肿瘤细胞免疫抑制和肿瘤诱导T细胞AICD模型。4） 合理选用RAS干预手段，调整RAS调节细胞免疫调节肿瘤免疫。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法a) 细胞生物学方法：肿瘤细胞的培养；人周围血T淋巴细胞的分离、纯化、培养和激活。b) 分子生物学方法：免
14、疫组化、RT-PCR、western blot、Northern Blot定性定量测定c) 免疫学方法：流式细胞仪测量细胞周期、双染色测定细胞凋亡；H3摄入测定细胞增生活性，JAM-Test定量测定细胞凋亡；免疫荧光法测定Caspase3活性。肿瘤细胞/淋巴细胞混合培养。技术路线分为两部分，两部分有交叉5实验方案说明：可行性分析本课题思路明确，技术路线可行，课题组成员均参加过省部级项目研究，具备相关实验技术和方法；已熟练掌握课题中所需要的细胞分子生物学技术，免疫学技术，流式细胞术，而且大部分技术在以往或正在进行的项目中使用；本课题组具有治疗普外科肿瘤包括胃癌、肝癌的丰富临床经验，在胃癌的免疫治
15、疗方面较有心得。以上情况说明我们有能力在此领域开展深入研究。本项目的创新之处：1. 率先开展对组织肾素血管紧张素系统对细胞免疫的调节作用的深入研究，结合细胞满意动力学分析明确RAS的免疫调节作用，并深入研究起作用的信号传导和细胞周期调控机制。目前尚未发现对RAS免疫调节作用较为系统的研究及相关文献。2. 率先开展RAS对肿瘤免疫调节作用的探讨，本研究可能的RAS干预方法机制调节肿瘤免疫。目前国内外在此方面尚是空白。4. 年度研究计划及预测进展2003年1月2004年12月：收集胃癌、肝癌组织标本。测定肿瘤组织RAS表达与正常组织的差别。2003年1月2003年5月：人周围血淋巴细胞RAS表达的
16、检测2003年3月2003年7月：完成Northern Blot、western Blot、RT-PCR等检测技术、CD3抗体/IL-2激活淋巴细胞、增生和凋亡检测等的技术考核。2003年8月2004年3月：完成RAS对免疫细胞增生、凋亡和细胞因子分泌的作用检测。2004年4月2004年5月：阶段总结，合理调整思路，准备对RAS调节机制的研究。2004年5月2004年12月：RAS免疫调节细胞信号传导通路的研究。2005年1月2006年5月：RAS免疫调节细胞周期调控的研究。2005年6月2005年9月：RAS对肿瘤免疫调节的初步研究。2005年10月2005年12月：统计数据，结合分析得出结论。5. 预期研究成果1）明确RAS在
