第三章 核酸扩增技术PPT课件

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1、 第三章 核酸扩增技术PolymeraseChainReactiontechniques 大纲要求 掌握PCR的原理和反应过程掌握PCR反应体系掌握PCR产物的检测熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法了解以PCR为基础的相关技术 Special 二 教学内容 第一节聚合酶链式反应第二节以PCR为基础的相关技术第三节PCR产物的检测第X节实时荧光定量PCR 现在位置P169 基础知识 遗传中心法则 现在位置P169 基础知识 基础知识 DNA加热变性 DNA冷却复性 一 核酸分子杂交的基本原理 基础知识 DNA变性 denaturation 定义 在某些理化因素作用下 DNA分子内碱基对之间的氢键

2、断裂 使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程 基础知识 基础知识 融解温度 Tm 定义 在DNA热变性时 其A260的升高达最大值一半时的温度 基础知识 meltingtemperature DNA复性 定义 变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程 称复性或杂交 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性 此过程称为退火 annealing 基础知识 基础知识 基础知识 dNTPdATPdCTPdGTPdTTP dNTP PCR概念 在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程 第一节聚合酶链式反应 现在位置P169 一 PCR的原理和反应过程 PC

3、R反应重复进行DNA复制的过程 使DNA得以扩增 每一次复制包括3个步骤 变性 denaturation 退火 annealing 延伸 extension 现在位置P125 变性 denaturation 将待复制的双链DNA经加热至94 95 左右一定时间后 DNA双螺旋的氢键断裂 使之成为单链分子 作为反应的模板 template 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 现在位置P170 退火 annealing 温度降低至寡核苷酸 oligonucleotide 引物的融点温度以下 40 70 使引物能与模板互补结合 形成杂交链 现在位置P125 延伸 extension 将温度升至72

4、左右 使反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3 端 使杂交双链不断延伸 以至形成新的DNA双链 现在位置P125 PCR的基本反应过程 变性95 C 延伸72 C 退火Tm 5 C 现在位置P170 40 70 C PCR的扩增效率 现在位置P170 循环次数 0123 n产物数量 2222 2 0 1 2 3 n 每一次循环后 一分子模板被扩增为两个分子每个循环所产生的DNA片段 即为下一个循环的模板PCR产物量以指数形式增长 模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2 二 PCR体系基本组成成分 现在位置P170 模板DNA特异性引物耐热D

5、NA聚合酶dNTPs缓冲液 二 PCR体系基本组成成分 现在位置P170 模板 template 模板就是将要被复制的核酸片段 包括基因组DNA RNA 质粒DNA和线粒体DNA等 在用RNA作为模板时 须先将RNA逆转录为cDNA 再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应 现在位置P125 耐热DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 TaqDNApolymerase 是从一种生活在热泉 80 90 中的水栖噬热菌 Thermusaquaticus 中提取的 有很高的耐热稳定性 TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成 即在模板指导下 以dNTP为原料 在引物的3 OH端 加上dNTP 在二者间

6、生成3 5 磷酸二酯键 使DNA链沿5 3 方向延伸 现在位置P170 dNTPs 即dATP dCTP dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物 反应体系中4种核苷酸的浓度必须一致四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率 浓度过高会加快反应速度 但导致非特异性扩增降低在dNTP浓度会提高反应的特异性一般为20 200umol L 现在位置P170 镁离子浓度 镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素 因为镁离子对于反应系统本身 稳定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影响 Mg2 浓度过低使酶活力降低Mg2 浓度过高又会使酶催化非特异性扩增 一般为1 5mmo

7、l L 现在位置P172 引物 Primer 引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸 oligonucleotide 分子 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度 现在位置P170 引物设计时必须遵循的原则 6条 用于PCR反应的引物需要二条 分别设在被扩增目标片段的二端 并分别与模板正负链序列互补 引物的长度一般以18 25个核苷酸为宜引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补 形成发夹状结构 引物过短则会降低扩增的特异性 现在位置P171 引物设计时必须遵循的原则 二条引物之间 尤其在3 端 的序列不可有互补 以免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡 避免出现嘌呤 嘧啶碱基堆积 C G的比例一般为45

8、55 现在位置P171 PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的 二条引物的Tm值不能差别太大 根据需要 合成引物时在其5 端可以加修饰成分如加入酶切位点 用生物素 荧光素 地高辛等标记 引入突变位点 引入启动子序列 引入蛋白质结合DNA序列等 现在位置P171 引物设计时必须遵循的原则 三 反应条件 1 温度 变性温度 一般把变性温度定在95 97 之间 以使模板DNA和产物双链完全打开 退火温度 退火温度决定PCR反应的特异性 退火温度的设定取决于引物的Tm 通常PCR的退火温度应低于引物Tm5 左右 延伸温度 一般为72 在这个温度下TaqDNA聚合酶具有较高的酶促活性 有利于D

9、NA的复制 现在位置P172 2 时间 PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增片段的长度 以长度为200 1000bp的扩增片段为例 循环中变性 退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为30秒 1分钟 在模板 尤其是基因组DNA 进行第1次变性时应给予足够长的时间 5 7分钟 根据变性温度高低而异 以使模板彻底变性 然后再进入循环 时间过长会降低扩增的特异性 现在位置P173 3 循环次数 循环次数一般为20 45次 PCR扩增效率呈S型曲线 有平台效应平台效应的原因 初始模板量引物二聚体和反应产物抑制扩增反应体系的组份被消耗引物与模板DNA间竞争 现在位置173 四 PCR技术的质量控制 硬

10、件方面实验室规范化设置软件方面样本采集核酸提取扩增产物分析测定结果的报送 现在位置P173 一 实验室的规范化设置 临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 这四个区域必须互相独立 并严格按照上述顺序设置 每一区域都必须配置专用仪器 所用物品 试剂和耗材不得从某一个区域移至另一个区域使用 现在位置P174 二 PCR技术的质量保证 PCR技术用于临床检验的质量保证主要涉及基因扩增检验全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 现在位置P129 二 PCR技术的质量保证 样本采集核酸提取扩增产物分析测定结果的报送 现在位置P129 一 目

11、的基因的克隆 二 基因的体外突变 三 DNA和RNA的微量分析 四 DNA序列测定 五 基因突变分析 四 PCR的主要用途 现在位置P 第二节 以PCR为基础的相关技术 一 逆转录PCR技术 二 巢式 三 定量PCR技术 四 多重PCR技术 五 PCR诱导定点突变 六 原位PCR技术 七 差异显示PCR技术 X 免疫PCR技术 现在位置P174 以PCR为基础的相关技术 一 逆转录PCR 逆转录PCR reversetranscriptionPCR RT PCR 是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术 由于耐热的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作为模板 因此首先必须将总RNA或

12、mRNA作逆转录 以生成与之互补的cDNA 然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增 得到所需的目的基因片段 RT PCR主要用于克隆cDNA 合成cDNA探针 检测RNA病毒和分析基因表达等 现在位置174 二 巢式PCR 巢式PCR nestedPCR 是对靶基因进行二次扩增 二次扩增所用的引物不能相同 第二次扩增所用的引物必须位于第一次扩增所用引物的内侧先用第一对引物扩增出一个较大的片段 再用第二对引物进行第二次扩增第二次扩增的模板是第一次扩增的产物 现在位置174 二 巢式PCR 现在位置174 引物1 引物2 nest 要扩增的目标基因 三 定量PCR 相对定量PCR定量PCR 实时荧

13、光PCR 现在位置175 四 多重PCR技术 多重PCR multiplexPCR 即在同一反应体系中加入多对引物 以同时扩增一份DNA样品中多个不同序列的靶片段 现在位置P179 四 多重PCR技术 多重PCR必须满足的两个条件 PCR反应条件适合所有被扩增的DNA片段同一反应内各扩增片段的大小应不同 以便检测时能通过电泳将各片段充分分离 现在位置P179 四 多重PCR技术 现在位置P179 四 多重PCR技术 现在位置P179 五 PCR诱导定点突变 DNA重组技术使我们能够首先用各种方法对克隆的DNA片段进行突变 在对产生的突变作DNA序列分析以后 再对突变体的特殊功能作进一步研究 现

14、在位置P180 六 原位PCR技术 insituPCR 组织固定处理细胞内的DNA或RNA 并以其作为靶序列进行PCR反应的过程称为原位PCR 原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备 经脱蜡处理的组织切片或滴加在载玻片上的细胞悬液都可作为扩增样品 所有步骤均在载玻片上进行 现在位置P134 六 原位PCR技术 insituPCR 进行PCR时 加入地高辛标记的的dUTP 使扩增产物带有地高辛 PCR结束 加入酶标抗地高辛抗体 再加入底物显色 现在位置P134 六 原位杂交PCR 原位杂交PCR与原位PCR的唯一区别 扩增结束后 用寡核苷酸探针与扩增产物作原位杂交 现在位置P134 七

15、差异显示PCR defferentialdisplayPCR DD PCR 现在位置P182 一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术 DD PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究 是目前筛选基因表达差异最有效的方法 X 免疫PCR immuno PCR IPCR 结合PCR技术和抗原抗体反应用于检测抗原 蛋白质 固相载体上包被有抗体1抗体2上标记有DNA 作为PCR的模板 现在位置P134 X 免疫PCR Immuno PCR IPCR 第一步 载体 抗体1 抗原PCR 现在位置P134 X 免疫PCR immuno PCR IPCR IPCR的灵敏度是ELISA的100 10

16、000倍 现在位置P134 第三节 PCR产物的检测DetectionofthePCRproduct 第三节PCR产物的检测 PCR完成以后 必须对扩增产物进行检测有效性和正确性 通过对PCR产物进行电泳分离 观察扩增条带的有无 扩增片段的大小等判断PCR反应的有效性和正确性 PCR产物定量 专门章节讲 序列是否正确 测序 现在位置P185 一 PCR 限制性片段长度多态性 是根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对PCR产物作限制性片段长度多态性分析的技术 若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内 可在突变点二侧设计引物 使PCR产物含有该突变序列 一种检测点突变的技术 应用十分广泛 现在位置P185 基因组中某个基因在同种生物的不同个体中 同时和经常存在的两种或两种以上的变异型 以至于用某种限制性核酸内切酶消化基因组的某段序列时 会呈现不同长度的消化片段 形成生物群体的多态性 这种多态性称为限制性核酸内切酶片段长度多态性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP EcoRI 5 GAATTC 3 5 NNNNNNNGAATT