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1、基因工程的原理和技术 基因工程的基本操作步骤 1 获得目的基因2 形成重组DNA分子3 将重组DNA分子导入受体细胞4 筛选含有目的基因的受体细胞5 目的基因的表达 一 获得目的基因 从基因文库中寻找 聚合酶链式反应 PCR 扩增 化学合成法 目的基因的核苷酸序列未知 目的基因的核苷酸序列已知 基因组文库部分基因文库 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 基因文库中不是直接保管相应基因 而是保存受体菌 菌中含基因 利用PCR提取目的基因 PCR 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 原理 DNA双链复制原料 模板DNA DNA引物 四种脱氧核苷酸 热
2、稳定DNA聚合酶 Taq酶 离子 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA 模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 前提 已知目的基因的脱氧核苷酸序列方法 DNA受热变性解旋为单链 冷却后DNA引物与单链相应互补序列结合 DNA聚合酶作用下延伸合成互补链 指数增长 归纳 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 100806040
3、20 72 94 55 PCR循环 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条
4、件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成 归纳 获取目的基因的方法 2构建载体 形成重组DNA分子 方法 同种限制酶分别切割载体和目的基因 再用DNA连接酶把两者连接 将重组DNA分子导入受体细胞 导入植物细胞 补充归纳导入方法 重组DNA分子导入农杆菌 再让农杆菌感染植物细胞 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法基因枪法
5、花粉管通道法 导入动物的方法 将目的基因导入动物细胞 显微注射法 将基因表达载体提纯 用显微仪注射到受精卵中 导入微生物 将目的基因导入微生物细胞 4检测和鉴定 Ca2 处理受体细胞成为感受态细胞 再进行混合 筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达 检测 是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定 功能活性鉴定抗性鉴定 分别提取什么进行检测 DNA 附着在膜上 硝化纤维素 加探针 报告基因 含荧光素分子 变性 DNA杂交 如检测SARS病毒等 a b c d 检测是否插入目的基因 利用DNA分子杂交技术 目的基因DNA一条链 作探针 与受体细胞中提取的DNA杂交 看是否有杂交带 检测是否转录出了m
6、RNA 利用DNA分子杂交技术 目的基因DNA一条链 作探针 与受体细胞中提取的mRNA杂交 看是否有杂交带 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗体与蛋白质进行抗原 抗体杂交 看是否有杂交带 还可以进行个体水平的鉴定 根据其性状 提示 DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA 然后高温解成单链 再与同位素标记的DNA探针杂交 抗原 抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫 产生相应的抗体 并提取出而来的 32 8分 将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗 饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力 以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表 08江苏 请根据以上图表回答下列问题 1 在采
7、用常规PCR方法扩增目的基因的过程中 使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶 其最主要的特点是 2 PCR过程中退火 复性 温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定 表1为根据模板设计的两对引物序列 图2为引物对与模板结合示意图 请判断哪一对引物可采用较高的退火温度 3 图1步骤 所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求 4 为将外源基因转入马铃薯 图1步骤 转基因所用的细菌B通常为 耐高温 引物对B 否 农杆菌 5 对符合设计要求的重组质粒T进行酶切 假设所用的酶均可将识别位点完全切开 请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列 对以下酶切结果作出判断 采用EcoR 和Pst 酶切 得到 种DNA片断 采用EcoR 和Sma 酶切 得到 种DNA片断 2 1
