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1、结核及耐药结核自动化检测技术 2020年4月 2014年全球结核发病率 来源 WHO2015年工作报告 2014年中国新发病例 8261552014年中国结核发病率 68 100000近几年我国结核发病率逐年下降 但仍然属于结核高负担国家 2014年全球耐药结核发病率 来源 WHO2015年工作报告 新发结核病例中的耐药结核比例 WHO估算2014年中国耐药结核发病数新发病例 43000复发病例 8200 我国属于耐药结核高负担国家 高负担国家的耐药结核发现 我国当前耐药结核防控的问题 不充分的耐药病人发现 不充足的耐药病人治疗 5 56 纳入治疗 结核诊治出现偏差 过多依赖X 光片或其他影像
2、学检查 忽略了以痰标本为基础的微生物诊断过多依赖未经验证 或不能作为诊断依据的测试 比如血清学检查只参考传统的微生物检测结果因为这些检测的不可靠性 WHO不得不采取非常规手段 特别提出反对这些测试的建议 全球结核控制不理想的问题出在哪里 结核诊断的常见技术 依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性敏感性为 50 结核 非结核分枝杆菌不能区分 NTM可能占到40 以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响2个月才获得药敏结果 导致患者脱落2个月后调整治疗方案 导致耐药患者的漏诊和传播无法更早确诊耐药结核患者 当前临床诊治的难点 结核诊断新技术 IGRAT SpotQuantiFeronNAAT技术等
3、温扩增检测技术线性探针基因芯片熔解曲线巢式PCR血清学检测 IGRA 原理 机体感染过结核分枝杆菌 T 淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时 产生和分泌特异性的细胞因子IFN 操作步骤 反转10次混匀37 C条件下孵育16 24小时2000 3000g离心15分钟用移液管取血浆每个孔内放50ul结合液加入50ul血浆 室温孵育120分钟洗板至少6次每个孔内加100ul底物 室温孵育30分钟加入50ul反应终止液450nm波长下读取吸光度使用专用软件计算结果 操作步骤 密度梯度离心分离外周血单个核细胞 PBMCs 洗涤PBMCs将PBMCs与特异抗原一同加入到预包被抗 干扰素抗体的培养孔37 C孵
4、育16 20小时洗涤培养孔加标记二抗孵育1小时洗涤培养孔加显色液用蒸馏水终止反应用肉眼判断结果 QuantiFERON TB T SPOT TB 采血量 2岁儿童 2 3ml免疫力低下患者 6 8ml其他患者 4 6ml 采血量 0 8 1 2ml 两者均有大量手工操作步骤 操作要求高QFT低采血量 更具优势 IGRA IGRA适用于高收入 结核低负担国家的潜伏结核筛查在中低收入国家 尤其是结核高负担国家 不推荐使用IGRA 将IGRA写入国家诊疗指南的有 美国 加拿大 英国 法国 西班牙 德国 意大利 瑞士 荷兰 丹麦 挪威 芬兰 爱尔兰 葡萄牙 捷克共和国 斯洛伐克 波兰 保加利亚 克罗地
5、亚 澳大利亚 沙特阿拉伯 韩国 日本WHO的推荐 欧美发达国家或 和结核低负担国家 2011年 IGRA在中低收入国家的政策声明 环介导等温扩增 设备要求较低操作复杂 人工判读结果 环介导等温扩增 中国CDC推荐可用于基层实验室无耐药检测WHO推荐对于持续有肺结核症状的成人可替代涂片 条件性推荐 可作为持续有肺结核症状的成人的 可作为涂片的后续检测 条件性推荐 备注适用于可开展传统涂片的实验室不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术 尤其是耐药结核高危人群由于缺乏证据 TB Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值 是否优于涂片尚不清楚TB Lamp的推荐只适用于检测持续有
6、肺结核症状的患者的痰液样本TB Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据 仅是推测 恒温扩增 试纸条法 操作步骤 将痰液液化 离心 灭活 制备成核酸扩增模板液取0 4ul移入1 5mlPCR管中 放入恒温装置中扩增使用水浴锅或金属浴 63 扩增1小时 将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增物试纸条检测装置中检测 15分钟目测定性结果 无需昂贵的仪器无耐药检测手工操作相对较少WHO未评估或推荐 恒温扩增 试纸条法 WHO在2015工作报告新技术章节中提到该技术但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据 实时荧光RNA恒温扩增检测技术 RNA检测技术 高灵敏度 可区分活菌和死菌
7、 适用于疗效监测需配备超声波仪 且仍需要实时荧光PCR仪检测无耐药检测WHO未评估或推荐手工操作步骤相对较少 线性探针 结果需要人工判读 或配备专门的设备 WHO2008年推荐用于涂阳标本检测MDR 2013年更新推荐检测二线药物全程检测需6 8小时配套设备繁多 需3个房间 需PCR仪 杂交仪等手工操作步骤繁多 复杂的结果判读 基因芯片 基于rpoB katG inhA的基因突变 快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两种一线抗结核药耐药 利福平 异烟肼WHO未评估或推荐鉴定与药敏需用两套试剂盒 鉴定药敏各需6小时配套设备 需不同PCR室 需PCR仪 杂交仪 扫描仪等 需配备扫描仪及配套软件判
8、读 熔解曲线 原理 一定环境下 DNA双链在其长度和序列一定时 Tm值也一定 发生错配时 Tm值下降 下降幅度与发生错配的碱基数目 类型和位置有关2 3小时获得结果 目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒WHO未评估或推荐配套设备 核酸提取仪 PCR仪等 分子信标 靶序列 杂交体 每个探针用不同的荧光染料标记 允许同时检测 PCR的目标是rpoB基因的81bp区域 5个探针结合到野生型 而不是突变体目标 SPC 半巢式实时荧光PCR Xpert WHO与FIND支持研发成果 It sadevelopmentthattheworldhasbeenwaitingfor forlitera
9、llydecades It ssomethingthathasthepotentialoftrulyrevolutionizingthewaywedealwithTBtoday WHOEndorsementofXpertMTB RIFTheTestthatisChangingtheWorld Dr MarioRaviglione Director StopTB WHO 2011年WHO评估完成后正式推荐 WHO全力推荐Xpert 各类分子诊断技术比对 液体培养 DST为金标准 陈琛等 分子线性探针测定法杖结核病诊断中的研究进展 中国防痨杂志 2016 38 218 XichaoOuetal A
10、feasibilitystudyoftheXpertMTB RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina InternationalJournalofInfectiousDisease 2015 31 41 WHO XpertMTB RIFassayforthediagnosisofpulmonaryandextrapulmonaryTBinadultsandchildrenPolicyUpdate Guo Yetal Rapid accuratedeterminationofmultidrugresistanceinM tuberculosisis
11、olatesandsputumusingabiochipsystem InternationalJournalofInfectiousDisease 2009 13 914 XichaoOuetal AmulticenterstudyofCross PrimingAmplificationfortuberculosisdiagnosisatperipherallevelinChina Tuberculosis 2014 94 428 黄芳等 三种分子生物学诊断技术对结核诊断价值的比较 中华结核和呼吸杂志 2015 38 680 WHO Theuseofacommercialloop media
12、tedIsothermalamplificationassay TB Lamp forthedetectionoftuberculosis May2013 王冰冰 荧光PCR熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药检测中的临床应用 国际检验医学杂志 2015 35 608 文献 3种分子诊断方法比对 无论涂阳培阳还是涂阴培阴 Xpert的检出率均最高 样本 根据 结核病诊断和治疗指南 收集2014年4 7月西安市结核病胸部肿瘤医院收治的经病理确诊或细菌性确诊的肺结核患者痰标本共378份 利福平耐药检测对MDR TB诊疗足够吗 INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案 与此相反 对RIF单耐药的患者
13、无论INH是否耐药 都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1 约90 利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药 也就是耐多药结核患者2 SvenO Friedrichetal SuitabilityofXpertMTB RIFandGenotypeMTBDRplusforPatientSelectionforaTuberculosisClinicalTrial JournalofClinicalMicrobiology 2011 49 2827 2831 XichaoOuetal AfeasibilitystudyofXpertMTB RIFtestattheperipherallevellaborat
14、oryinChina InternationalJournalofInfectiousDiseases 2015 31 41 46 结核 利福平耐药 对多耐结核控制产生的效果最为显著 即便补充异烟肼耐药 能提升的效果有限 WHO推荐Xpert用于肺外结核的初始诊断 共纳入15项已发表研究和7项未发表研究 涵盖5922例样本 大多数研究 59 来自结核高负担地区 WHO推荐Xpert用于结核的初始诊断 WHO数据 灵敏度66 特异性98 南非经验 2011年6月 2012年5月 484例患者 年龄中位数24个月 痰液都是非诱导痰63 的样本体积132月 的儿童阳性率更高XpertMTB RIF
15、灵敏度62 5 25 91 特异性99 1 98 99 9 涂片 灵敏度33 8 7 特异性99 5 98 99 9 Xpert检测儿童痰液 明显优于涂片 检测粪便标本性能同样优异 痰液 粪便 易于使用的样本处理器 0 6g 1 2g 拭子 粪便 0 6g 的性能和呼吸道标本效果相当 且非侵入式样本更适合儿童 快速 即时的分子诊断实现检测就治疗 韩国 国立首尔大学医学院2011年1月 2013年5月681例患者XpertMTB RIF可将从接诊到开始抗结核治疗的平均时间从21天缩短为6天 南非全国使用Xpert逐步替代涂片 耐药结核负担明显下降 2016CATA 南非NHLS优先项目负责人We
16、ndyStevens教授分享南非经验 南非在矿区及矿区周边社区使用Xpert对重点人群进行筛查 南非用Xpert检测肺外结核经验 约翰内斯堡研究 n 1175 Xpert检出率是260 1175 与液体培养相当277 1175Xpert灵敏度59 CI53 65 特异性92 CI90 94 脓 抽吸物的的灵敏度最高 然后是 腹水 然后是胸水 浓稠样本的灵敏度最高87 CI76 94 清液样本灵敏度较低48 CI36 61 痕量血液不影响检测性能52 CI44 60 离心也不影响检测性能57 CI28 82 Xpert相比液体培养 10 5 污染 不容易受污染影响 同时可更早获得利福平耐药结果 Xpert检测脓和抽吸物的特异性低于呼吸道样本 但这些都是真阳性 未来 XpertUltra替代培养 XpertMTB RIF痰液的检测下限为50 165CFU ml 2小时出结果检测靶标 rpoB基因 5个探针检测突变 25ulDNA用于PCR反应涂阴标本的灵敏度60 80 替代涂片的策略 XpertUltra痰液检测下限为5 25CFU ml新的样本处理试剂盒 50ulDNA用于PCR反应 检
