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1、厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程起草单位：中国科学院微生物研究所目 次前 言. 3厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程. 41 范围. . 42 术语和定义. . 43 样品采集. . 44 样品分离. . 55 分离菌种的培养. 6参考文献. 7前 言对于厌氧细菌和古菌，在进行取样、分离和培养的各个环节均必须注重这类微生物的特性，采用相适应的方法，使采集的样品具有代表性，尽可能保持其在原生境的种类和数量，并通过分离和培养将其反映和显示出来，同时取得所需的试验菌种。本规程规定了厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养的方法和要求。厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程1范围本规程
2、规定了厌氧细菌和古菌样品采集的要求及根据样品量的大小所应采取的采样方法；规定了厌氧细菌、古菌样品分离和培养的具体方法。本规程适用于不同生境中厌氧细菌和古菌样品的采集；以及各类厌氧细菌和古菌的分离培养。2术语和定义本规范采用下列术语和定义。2.1厌氧细菌和古菌 Anaerobic Bacteria and Archaea厌氧细菌和古菌如梭菌属（Clostridium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等，是指要求在没有分子氧条件下才能生活的各种细菌和古菌。本文所指厌氧细菌和古菌为专性厌氧细菌和古菌，2.2Hungate 厌氧技术 Hun
3、gate methodHungate 厌氧技术是美国微生物学家 Hungate 于 1950 年发明的一套有效的用于厌氧菌分离和培养的技术，它包括培养基预还原和在无氧环境中进行的菌株分离和培养操作技术。利用该技术，许多严格厌氧细菌和古菌的分离、培养获得了成功。2.3厌氧手套箱 Anaerobic chamber (glove box)厌氧手套箱利用预置在箱内的钯催化剂，催化氢气与氧结合生成水，从而达到除去箱内氧气的目的。它包括操作室和交换室两部分。操作室用于厌氧分离、培养，交换室用于操作室内外物品的传递。3样品采集采集厌氧细菌和古菌样品时，应尽可能避免将样品较长时间暴露于空气中,尽快将采集的样
4、品带回实验室。根据放置样品所用容器的不同，可将样品的采集方法分为：厌氧试管法、厌氧罐或厌氧袋法、棉拭子法三种，采集时应视具体情况，选择其中一种方法。3.1厌氧试管法3.1.1仪器和用具3.1.1.1 厌氧试管带丁基胶塞的可密封的试管、小瓶，或其他容器。可通入无氧气（O 2）的氮气（N 2）、二氧化碳气体（CO 2）、或氮气、二氧化碳气体和氢气的混合气体（CO 2、N 2和 H2），以置换管内空气，创造厌氧条件。3.1.1.无菌注射器。3.1.2稀释液常用磷酸盐缓冲液做为稀释液（NaCl 0.85g，Na 2HPO4 0.25g， NaH 2PO4 0.56g，蒸馏水 100ml）。3.1.3取
5、样对于土壤、污泥等可大量获得的样品，可将样品直接装入灭菌的厌氧试管中，直至装满，塞上胶塞，拧紧螺口胶盖。对于从动物肠道、口腔等部位采集的少量样品，直接将样品迅速装入灭菌的、盛有预还原稀释液的厌氧试管内，立即塞上胶塞，拧紧螺口胶盖。对于液体样品应用无菌注射器抽取样品，取样后立即排除多余空气，将样品注射进灭菌的厌氧试管中。3.2厌氧罐或厌氧袋法3.2.1仪器和用具3.2.1.1 厌氧罐或厌氧袋可以密封的容器。利用化学方法，去除容器中的氧气，创造厌氧环境。3.2.1.2 灭菌的平皿、三角瓶或试管3.2.2取样将样品尽快装入灭菌的平皿、三角瓶或试管等器皿中，然后放入厌氧罐或厌氧袋内。3.2.3棉拭子法
6、采取临床样品时常用此法。3.3.1仪器和用具3.3.1.1 厌氧试管同 4.1.1.1。3.3.1.2 棉拭子无菌棉拭子，装在厌氧试管中。3.3.1.3 半固体琼脂培养基去除氧气的半固体培养基，分装在厌氧试管中。3.3.2取样用棉拭子采样后，直接插入装有半固体培养基的厌氧试管内。4样品分离厌氧细菌和古菌样品的分离，通常采用系列稀释滚管法或平皿涂布法。对于样品中含量很少的微生物如光合细菌，应先用富集培养基对其进行富集培养，然后利用选择性培养基进行分离。4.1滚管法4.1.1仪器和用具4.1.1.1 厌氧试管同 3.1.1.1。4.1.1.2 振荡器4.1.1.3 无菌注射器、弯头毛细管、乳胶管4
7、.1.1.4 盛有冰块的托盘或滚管机4.1.1.5 显微镜4.1.2稀释液同 4.1.2。4.1.3滚管分离4.1.3.1 样品稀释取 1g 或 1mL（混合均匀的液体）样品，置于装有 9mL 或 4.5mL 预还原稀释液的厌氧管内,在振荡器上振荡均匀，用无菌注射器取 1mL 或 0.5mL 样品稀释液加至另一装 9mL 或 4.5mL 的稀释液的试管内。按此操作依次制备成 10-110-9的样品稀释液，备用。4.1.3.2 滚管将盛有无氧无菌琼脂培养基的试管加热至 100，使琼脂熔化，并保温在50左右的水浴中，备用。用无菌注射器取至少 3 个稀释度的样品稀释液 0.1-0.2mL，加入盛有溶
8、化的预还原培养基的厌氧试管内，将试管平放于盛有冰块的盘中或放在特制的滚管机上迅速滚动，培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。适温培养后，在琼脂层内或表面形成菌落。滚管前最好用显微镜观察待分离的样品，了解样品中的细菌或古菌形态类型及其浓度，作为分离样品的参考。4.1.3.3 分离培养挑取单菌落时，将形成单菌落的试管和一支盛有无菌、厌氧培养液的试管固定在适当的支架上，去掉试管的胶塞，插入灭菌的注射器针头，通入气流速度适当的、无菌的、高纯氮气。将无菌弯头毛细管小心插入形成单菌落的试管内，轻轻吸取预先作好标记的单菌落，转移至盛有厌氧培养液的试管内，塞上胶塞，拧紧螺口胶木盖，适温培养。形成的菌落需及时进行单
9、菌落的挑取和移植，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释、滚管，并再次挑取单菌落，直至获得纯培养物为止。分离的单菌落也可在厌氧手套箱内挑取。4.2平皿涂布法4.2.1仪器和用具4.2.1.1 厌氧罐或厌氧手套箱4.2.1.2 玻璃刮刀4.2.2涂布分离根据 5.1.3.1 中所述方法对样品进行稀释，于厌氧手套箱中，取一定稀释度的样品稀释液 0.2-0.5mL 置于琼脂平板上，用玻璃刮刀涂抹均匀，置于厌氧罐或厌氧手套箱中，适温培养。待形成菌落后，及时在厌氧环境中进行单菌落的挑取和移植。5分离菌种的培养分离得到的厌氧细菌或古菌，应接种在适宜其生长的厌氧培养基中，置于厌氧环境中，适温培养。
10、5.1仪器和用具5.1.1厌氧试管同 4.1.1.1。5.1.2厌氧手套箱、厌氧罐，或厌氧袋5.1.3细口圆底烧瓶5.2厌氧培养基的制备5.2.1制备采用煮沸法去除培养基中的氧气。将盛有已熔化的培养基（已加入氧化还原电位指示剂刃天青（Resazurin）的细口圆底烧瓶，在酒精灯上加热，煮沸培养基，同时通入纯度为 99.99%的高纯氮气，氧气已被完全去除后，培养基从红色变为无色，此时加入规定用量的半胱氨酸。5.2.2分装制备厌氧培养基的同时，将纯度为 99.99%的高纯氮气通入空的试管中。去除试管中的氧气。将上述无氧培养基分装进厌氧试管中，塞上胶塞，拧紧胶木盖，灭菌备用。5.3厌氧细菌和古菌的培
11、养将分离得到的厌氧细菌或古菌接种在适宜的厌氧培养基中，直接在厌氧试管中进行培养，或者在可获得厌氧环境的装置中进行培养，如厌氧手套箱、厌氧罐或厌氧袋等。参考文献1 凌代文, 东秀珠. 1999. 乳酸细菌分类鉴定及试验方法. 北京：中国轻工业出版社. 1-1762 王祖农等. 1990. 微生物学词典. 北京: 科学出版社3 Sutter, V.L.,Citron, D.M.et al. 1980. Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, 3rd ed. C.V.Mosby Company.4 Holdeman, L.V., Cato, E. P. &
12、Moore, W. E. C. (1977). Anaerobe Laboratory Manual, 4th edn. Blacksburg, VA: Virginia Polytechnic Institute and State University.厌 氧 微 生 物 的 分 离 与 培 养一、实验目的熟练掌握 Hungate 厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。二、实验用具装有分压表的氮气钢瓶，氢气钢瓶，调压变压器，铜柱和铜柱固定架，高压灭菌锅，厌氧管（15ml）,厌氧瓶(50ml)，异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶（500ml 、1000ml ）、各种规格的
13、定量注射器（1ml、2ml，5ml），18#针头，酒精灯，酒精棉等。三、实验操作(一)、高纯无氧 N2 的制备1、 接通电源：把输出电压缓缓从 0 伏分级升到 5090 伏之间（调电压的过程持续大约 2-3s就可以了）。大约 20 分钟后，铜柱温度能达到 350左右（输出电压禁止长时间超过 90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形直至破裂，甚至发生安全事故）。2、 待铜柱温度升至 350左右时，加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜柱内的铜丝还原（反应速率很快，几秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致；通氢气的时候最好打开窗户，一定熄灭操作
14、台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。3、 待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零；打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背 5cm 距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。4、 使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回至零位，接着关闭电源，使调压变压器调节指示回至 0 伏处。(二)、无氧无菌水的配制1. 将 500ml 一定浓度的 NaCl 水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的 1000ml 圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），最好放入几个防爆玻璃珠。向 500ml 水中加入终浓度为 0.001的刃天青（resazurin），即加入 0.5ml 的 1刃天青母液（W/V），并加入 0.25g 半胱氨酸（ L-Cysteine）(终浓度0.5)。在烧瓶外壁溶液水平面处划一刻度后，加入适量水（因为蒸发会损失部分水分）。煮沸 5-10min（视所加水总量而定），刃天青会根据水中含氧量的下降经历紫色-红色-无色的颜色变化，当溶液变为无色后，再煮沸 5min，然后通高纯氮气 1-2min（赶走空气）。2. 分装的过程可以不用继续加热，用 10ml 的定量注射针筒抽进氮气流，再打出（三次以上）洗气，然后抽取 9ml 无氧水注入已换气的 15ml 厌氧管中（抽取注
