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1、 虞其红 遗传性血液病 血液与遗传的关系是十分密切的 目前发现的遗传性血液病已经在百种以上 造血和淋巴组织系肿瘤中几乎都是属于染色体病和体细胞遗传病 在体细胞水平上遗传物质的异常能扰乱细胞的正常生长发育及分化调节 从而诱发肿瘤 在白血病中 多数是由染色体易位导致原癌基因的重排 原癌基因重排可以导致癌基因的过量表达而致病 也可由于原癌基因与易位处的某一基因形成融合性基因而发生白血病 发病情况我国白血病发病率发病率 1 4 10万 低于欧美 ANLL1 62 10万 ALL0 69 10万 CML0 36 10万 CLL0 05 10万 急性比慢性多 成人急非淋多见 儿童急淋多见 欧美慢淋多见 易
2、发人群 儿童及35岁以下成人 死亡率 恶性肿瘤中6位 男性 8位 女性 白血病分类分形 据白血病细胞的成熟程度和自然病程 将白血病分为急性白血病 AL 和慢性白血病 CL 两大类 根据主要受累的细胞系列将 AL分为 急性淋巴细胞白血病 ALL 和急性非淋巴细胞白血病 ANLL 或急性髓性白血病 AML CL分为 慢性粒细胞白血病 CML 慢性淋巴细胞白血病 CML 及少见类型的白血病 如毛细胞白血病 HCL 幼淋巴细胞白血病 pLL 等 随着血液病在发病机理 诊断方法以及治疗手段等方面的进展 急性白血病的诊断技术也有很大发展 急性白血病的分型基本上分三个阶段 急性白血病分型的三个发展阶段 FA
3、B分型1976 M MIC分型1986 MIC WHO分型2001 MICM 70年代 1976 Benne等 法 美 英7位学者提出FAB分型 其后多次加以修改补充 70年代中用单克隆抗体发现造血细胞表面抗原 对AL进行免疫表型分析 Chromosome分析90 AL有核型异常 80年代提出MIC分型 M morphology I immunology C Cytogenetics 近年MICM MIC 分子生物学 分型 急性白血病 AL 急性白血病是 造血干细胞的恶性克隆性疾病 发病的骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞 白血病细胞 大量增殖并广泛浸润肝 脾 淋巴结等各种脏器 抑制正常造血 主要
4、表现为贫血 出血 感染和浸润等征象 分类 国际常用的法美英 FAB 分类将AL分为ALL及ANLL 或急性随性随性白血病AML 两大类 这两大类再分成多种亚型 一 急性淋巴细胞白血病 ALL 分型 FAB分型 ALL L1原始淋巴细胞以胞体小 直径 12 m 而规则为特点 ALL L2原始淋巴细胞则以大小不一 直径 12 m 和胞核形状不规则见长 ALL L3原始和幼淋巴细胞以大细胞为主 大小较一致 细胞内有明显空泡 胞浆嗜碱性 染色深 因与EB病毒感染有关故又称Burkitt细胞 在免疫表型上则为成熟型B细胞 另外 由于形态学分型为基础的FAB分型具有一定的局限性 如 T B淋巴细胞不能区分
5、 没有没有提供染色体异常和基因重排等对发病机制 治疗选择和对预后判断重要意义的信息 因此除形态学外还应做免疫学分型 急性淋巴细胞白血病 的MIC分型 B系1 早前B细胞型ALL 早前B ALL 2 前B细胞型 前B ALL 3 普通型ALL 4 成熟 细胞型ALL B ALL T系早前T细胞型ALL T ALL 成熟T细胞型ALL T ALL 急性髓性白血病 AML 的FAB分型 AML共分8型如下 M0急性髓细胞白血病微分化型M1急性粒细胞白血病未分化型M2急性粒细胞白血病部分分化型M3急性早幼粒细胞白血病 APL M4急性粒单核细胞白血病 AMML M4Eo除上述M4型的各特点外 嗜酸性粒
6、细胞在NEC 5 M5急性单核细胞白血病 AMoL M6红白血病 EL M7急性巨核细胞白血病 白血病染色体畸变与非随机性 一 集中倾向性从理论上说 人类的24种染色体 常染色体加X和Y性染色体 以均等机会参与肿瘤的畸变 但现实的研究结果并非如此 肿瘤染色体畸变常是涉及其中部分的染色体 畸变分布不均 且带有某种集中倾向 聚集现象 和非随机性Mitelman曾对1266例一白血病为主的15种肿瘤进行染色体畸变分析 可见肿瘤染色体畸变集中在第1 3 5 7 8 9 14 17 20 21 和22号染色体中 而第1 8和14号染色体则涉及7 8种肿瘤 在肿瘤染色体重排的研究中 恶性肿瘤染色体重排分布
7、和良性肿瘤染色体畸变均是非随机性的 二 地域分布研究地理分布的非随机性 也可发现肿瘤染色体畸变发生率存在地区异质性 CML中 欧洲和日本 17的频率高于澳大利亚与美国 日本 19的频率是欧美的3倍 AML中 美国 5和 7的频率比澳大利亚高2倍 而在日本则为罕见 淋巴瘤14q 发生的频率 在欧洲为47 美国为83 CLL的t 8 14 在欧洲为67 在美国则未见 我国及东南亚较少见 三 年龄分布11q23重排是婴儿AML患者最常见的细胞遗传学异常 而在成人中的发病率仅为5 t 1 22 p13p13 仅限于儿童M7 尤其是婴儿患者 5 7 i 17q 完整的第8 11 13和14号染色体的三体
8、 以及复杂核型均多见于年龄较大的患者 t 15 17 t 8 21 t 6 9 t 6 16 t 3 5 等异常核型则常见于年轻患者 四 标记染色体分布在肿瘤染色体的检测中 标记染色体的分布也是非随机的 5q 常见于难治性贫血和治疗相关AML和MDS6q 在ALL中的发生率为20 在淋巴瘤中的发生率为12 在CLL CGL AML及其他恶性肿瘤中少见 7q 常见于所有的白血病 最常见的为AML14q 主要见于淋巴系肿瘤 少见于其他恶性肿瘤 t 8 14 在B系白血病和淋巴瘤中是特异的 其断裂位点是专一的 i 17q 为CML急性期的特征 少见于其他肿瘤 20q 主要见于真红细胞增多症 22q
9、则广泛存在于白血病中 骨髓染色体核型分析 肿瘤有超过600种染色体结构异常的核型 绝大多数血液肿瘤都有非随机的染色体畸变 血液病 急性非淋巴细胞白血病 急性淋巴细胞白血病 慢性粒细胞白血病 骨髓增生异常综合征 63 淋巴瘤 10 实体肿瘤 27 1 由于肿瘤细胞在体外的增殖能力较差 中期细胞数量少 2 肿瘤细胞的染色体核型形态较差 难分析 3 细胞毒性药物的治疗也会影响骨髓细胞培养成功率 最好是治疗前的标本进行培养 MPD中的骨髓抑制治疗以及MDS中的支持治疗也往往干扰细胞培养的结果 4 不同培养方式 检出率不同 如t 15 17 类型的病例 需要进行24 48小时的培养才能得到结果 技术难点
10、 骨髓细胞染色体分析流程图 骨髓细胞 骨髓培养基 24h 秋水仙胺5h 0 5h 染色体制备影响因素分析 1 培养基pH 浓度 小牛血清量及培养箱温度的恒定是培养成功的关键 2 适量秋水仙素 适宜的处理时机和时间 是获得良好 足够分裂相的条件 分裂相的多少和染色体形态及带型处理良好与否均受其影响 3 低渗处理是获得分散良好的分裂相的关键步骤 低渗过度或不足都会造成染色体形态不良的结果 在低渗处理时期细胞十分娇嫩 并且表面发黏 低渗细胞混匀时 吹打要适宜 避免细胞破碎及粘团 另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部 避免细胞丢失 4 固定技术是制备良好分散的染色体的重要步骤 若染色体分散不良 可适
11、当加大冰乙酸含量 其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷 但过量会造成染色体形态变化和影响分带结果 染色体形态不良与加固定液速度有关 加第一次固定液快或过快 可造成飘带样染色体 5 固定液每次使用必须新鲜配制 否则将会形成酯类 从而影响固定效果 6 滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步 首先是载玻片要非常干净 否则会影响染色体的分散和分带效果 其次是滴片的距离 制片的方式都会影响染色体分期效果 烤片的温度 时间与染色体形态和分带有关 不宜温度过高和烤片时间过长 常用染色体带纹显示方法 R banding G banding G Giemsa 带 Giemsa显带 经典方式
12、常用于临床R Reverse 带 与G显带带纹相反 可观察染色体的末端缺失 染色体阅片的七大影响因素 1 染色体分裂指数低2 染色体形态不理想3 染色体形态偏长 4 染色体形态偏短5 染色体分带不良6 染色背景不良7 培养失败 白血病类型的细胞遗传学表现 由于绝大多数白血病患者都有非随机的染色体畸变 它们对于白血病的诊断分型 预后估计 治疗方案的选择乃至发病机制的研究都有极为重要的价值 尽管染色体改变的种类繁多 但具有四种基本特征 获得性 克隆性 原发性和继发性 平衡性和不平衡性 获得性 获得性 白血病染色体畸变为后天获得而非先天遗传 许多研究表明 如同卵双生子之一患CGL ph染色体不见于其
13、健康的孪生同胞 白血病患者所生子女通常缺乏同样的白血病和核型异常的证据 白血病患者其染色体畸变通常不见于皮肤和结缔组织 克隆性 克隆性 是指来自同一个恶性转化细胞的一群白血病细胞具有相同的染色体异常 原发性和继发性 原发性和继发性 原发性畸变是指发生于疾病早期 与白血病的发生有关 和白血病的细胞学 免疫学有关 因而对白血病有分类和标志性的意义并决定其生物学特征的一类异常 继发性畸变 指病程中由于克隆衍化所致的异常 它虽和疾病的发生无关 但却赋予疾病更加恶性的特征 平衡性和不平衡性 平衡性和不平衡性 平衡性畸变是指白血病患者的染色体异常 常表现为染色体的结构重排 如相互易位或者是倒位 而无DAN
14、含量的改变 非平衡性畸变是指染色体异常常表现为整条染色体或部分的增加或丢失 而有DAN含量的改变 1 染色体数目异常 1 多倍体 2 非整倍体 2 染色体结构异常 1 缺失 2 插入 3 倒位 4 易位 5 重复 6 环状染色体 7 等臂染色体 8 双着丝粒染色体 常见结构异常的符号及含义 一 慢性粒细胞白血病 CML Ph染色体 ph染色体是9和22号染色体易位后的der 22 t 9 22 q34 q11 Ph染色体见于全部的髓系细胞 一部分B系细胞和极少数的T系细胞 这表明 是多能造血干细胞突变所致的克隆性疾病 由于 号染色体长臂上的断裂点是变化的 因而导致 种不同大小的 染色体 型 最
15、大 断裂点位于 型 大 断裂点位于 型 中等 断裂点位于 型 最小 断裂点位于 其中前两型少见 后两型较多见 白血病类型的细胞遗传学表现 2 Ph易位的类型 变异易位隐匿易位 典型易位t 9 22 q34 q11 CMLt 9 22 q34 q11 CML不典型Ph易位 慢粒慢性期的染色体改变 46 t 9 22 t 9 22 Y 8 Ph CMLt 9 22 Y 慢粒急变期的染色体改变及其意义 20 保持46 t 9 22 不变80 除t 9 22 外出现额外异常 依次为2Ph 8 i 17q 19 21等少数病例Ph染色体可和t 8 21 t 15 17 inv 16 或inv 3 同时存
16、在额外异常比临床血液学急变征象早出现2 4个月无额外异常组80 对治疗有反应 MS5 7个月部分细胞有额外异常组50 对治疗有反应 MS4 9个月全部细胞有额外异常组成30 对治疗有反应 MS2 5个月 慢粒的细胞遗传学分型 Ph bcr 50 Ph bcr 50 Ph Ph 二 慢淋的染色体变化 121 3染色体异常CLL数目异常 3 6 18 5 B细胞慢淋14q 25 染色体异常CLLt 11 14 q13 q32 t 14 19 q32 q13 结构异常del 13q 20 染色体异常CLLi 17q 6q T细胞慢淋inv 14 q11q32 CLL 12 CLL13q i 17q CLL 7 t 8 22 11q mar 2 T CLLinv 14 三 急非淋 急髓白血病的染色体改变 染色体异常检出率50 80 最高达93 检出率高低主要与方法学有关 其次与地理环境及种族的差异有关原发性核型异常分两大类和FAB亚型相关 特异性染色体重排和FAB亚型不相关 大多为数目异常初诊时核型异常在CR时消失 复发时再现部分病例由于核型演化产生继发性异常 ANLL AML和FAB亚型相关
