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1、外周血中DNA的提取与鉴定 实验目的 掌握人全血DNA提取的原理和操作步骤 了解DNA基本理化性质 3 初步了解DNA琼脂糖电泳鉴定的方法 实验原理 理论上所有真核细胞 原核细胞 病毒等都可以提取DNA 样本选择取决于实验目的 全血是基因组提取中最常见的样本之一 样本来源 理化性质 核酸是由碱基 戊糖及磷酸组成的生物大分子 分为脱氧核糖核酸 DNA 和核糖核酸 RNA 两类 1 酸碱性核酸分子中有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基 属于两性化合物 但是磷酸基的酸性较强 所以核酸总体上表现为酸性 带负电荷 2 溶解度与粘度核酸是极性化合物 微溶于水 其钠易盐溶于水 而不溶于乙醇 苯酚 氯仿 乙醚等有机
2、溶剂 核酸是高分子化合物 粘度很大 3 紫外吸收核酸有强烈的紫外吸收 其最大吸收峰在260nm处 常以A260表示 实验原理 生物的大部分或几乎全部的DNA都集中在细胞核或核质体中 人与动物的DNA主要存在于细胞核中 并与蛋白质结合的构成大小不一的染色体 所以蛋白质是DNA提取过程中常见的污染之一 而且蛋白质污染常常影响到以后的DNA操作过程 因此提取过程中要把蛋白质去除 实验原理 本实验中DNA提取采用的是苯酚 氯仿抽提的方法 基本原理就是苯酚 氯仿对蛋白质有极强的变性作用 而对DNA却没有影响 经苯酚 氯仿抽提后 酚 氯仿相与水相完全分层 蛋白质变性而被离心沉降到酚 氯仿相和水相的界面 D
3、NA则留在水相 标本中的脂类杂质溶解于酚 氯仿相 从而与水相分离得以去除 实验原理 此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质 但是RNA极易降解 而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响 如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染 实验步骤 1 首先取EDTA抗凝的人外周血2mL 按照1 5 1 10的比例加入去离子水裂解8min 然后1700rpm min离心 去掉含有红细胞碎片的上清液 重复裂解一次 留取白细胞沉淀 实验步骤 DNA细胞裂解液 pH8 0 150mmol LNaCl 10mmol LTris HCl 10mmol LEDTA 0 5 SDSDNA细胞裂解液
4、中SDS的是表面活性剂 主要作用裂解细胞膜 核膜 使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面 另外 Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相 减少在蛋白质层的滞留 2 加入0 5mL的DNA细胞裂解液来悬浮白细胞沉淀 实验步骤 3 悬浮后的溶液中添加蛋白酶K20 L 65 水浴0 5h 期间轻缓地倒转几次 4 室温下 添加0 5mL的苯酚 氯仿 异戊醇混合抽提液 剧烈地震荡混合10min 然后8000rpm min离心10分钟 然后将水相移至新的离心管中 细胞膜裂解以后 细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中 而蛋白酶K具有水解蛋白质和DNA酶的作用 并且在EDTA和SDS存在的条
5、件下仍保持较高的活性 在苯酚 氯仿加入少量的异戊醇 可以减少实验中气泡的产生 而且有利于分层 保持分层的稳定性 实验步骤 5 添加1mL的预冷的无水乙醇到水相中 混匀 8000rpm min离心3分钟 加入无水乙醇可以吸收水相中的水分 使得DNA沉淀析出 6 沉淀用70 的预冷乙醇洗涤两次 然后干燥 最后用50 L去离子水悬浮 70 的冰乙醇可以去除可溶性的多糖 金属离子等杂质以及残留的苯酚 氯仿等 实验步骤 7 用1 的琼脂糖电泳鉴定所提取的DNA 8 剩余的DNA贮存在4 冰箱中 备用 注意事项 一 提取染色体DNA最根本的要求就是保持核酸的完整性 所以操作过程中要注意 1物理因素高分子量的DNA长而弯曲 仅有极微的侧向稳定性 机械张力和高温很容易使DNA分子发生断裂 因此 实际操作过程中尽量轻缓 尽量避免过度的溶液吹打转移 以及过高的温度 2化学因素在过酸的条件下 由于DNA脱嘌呤而导致DNA的不稳定 容易在碱基脱落的地方发生断裂 因此避免使用过酸的条件 二 步骤3转移水相时 此时的水相可能比较粘稠 必须非常的小心将水相吸入新离心管并防止搅动和吸入分层界面的杂质蛋白 三 在提取过程中 使用离心管及枪头都应该是干净无菌的 相应试剂配制及保存要规范 谢谢
