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1、 参考资料 动物组织中硝基呋喃代谢物残留量的测定方法 毕业论文 第第一一章章目目 录录 摘 要 I ABSTRACT 英文摘要 目 录 第一章 引 言 1 1 1 硝基呋喃类药物的性质和使用 1 1 2 硝基呋喃类药物的危害及其管理对策 2 1 2 1 硝基呋喃类药物的主要危害 2 1 2 2 硝基呋喃类药物的管理对策 3 1 3 硝基呋喃类物质及其代谢物的样品处理方法 4 1 3 1 样品的均质 4 1 3 2 提取和衍生化 5 1 3 2 1 溶剂提取 5 1 3 2 2 水解和衍生化 5 1 3 3 样品的净化 6 1 3 3 1 液液萃取 LLP 6 1 3 3 2 基体固相分散技术
2、MSPD 6 1 3 3 3 固相萃取技术 SPE 7 1 3 3 4 在线透析和微量富集技术 7 1 4 硝基呋喃类物质及其代谢物的检测方法 8 1 4 1 色谱分析方法 8 1 4 1 1 高效液相色谱法 HPLC 8 1 4 1 2 联用技术分析法 10 1 4 2 分光光度法 12 1 4 3 免疫分析法 IA 13 参考资料 1 4 4 总结 14 第二章 实验方法 17 2 1 原理 17 2 2 仪器和设备 17 2 3 试剂与溶液 18 2 3 1 主要试剂 18 2 3 2 主要溶液的配制 18 2 3 3 标准物质和标准溶液 19 2 4 实验方法 20 2 4 1 试样制
3、备与保存 20 2 4 2 分析步骤 20 2 4 2 1 洗样 20 2 4 2 2 水解 20 2 4 2 3 提取和净化 20 2 4 2 4 仪器参数与设定 21 2 4 2 5 液相色谱 串联质谱测定 22 2 4 2 6 定性方法 22 2 4 2 7 定量方法 23 第三章 结果计算及讨论 24 3 1 结果计算 24 3 2 总离子流图和保留时间 24 3 3 样品衍生条件的优化 25 3 4 净化条件的选择 26 3 5 质谱条件的优化 26 3 6 检测限 测定低限 回收率和精密度 29 3 6 1 回收率统计 29 3 6 2 重复性统计 33 3 7 內标法定量 38
4、3 8 标准曲线图谱及线性围 39 参考资料 3 8 1 标准曲线图谱 39 3 8 2 线性围 41 3 9 质量控制及注意事项 41 3 9 1 质量控制 41 3 9 2 注意事项 42 结论 44 参考文献 45 致谢及声明 48 参考资料 参考资料 第一章 引 言 1 11 1 硝基呋喃类药物的性质和使用硝基呋喃类药物的性质和使用 硝基呋喃类药物 Nitrofurans 是人工合成的具有5 硝基呋喃基本结构的 广谱抗菌药物 对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 某些真菌和原虫均有 作用 在低浓度下对上述病原体有抑制作用 高浓度则有杀灭作用 其抗菌作 用机理是干扰细菌体的氧化还原酶系统
5、使细菌代谢紊乱 1 硝基呋喃类抗生 素主要包括呋喃唑酮 Furazolidone 呋喃它酮 Furaltadone 呋喃西林 Nitrofurazone 呋喃妥因 Nitrofurantoin 等 见图1 1 呋喃类物质均为 性质稳定的黄色粉末 无味或味微苦 呋喃西林难溶于水 1 4200 微溶于乙 醇 1 590 呋喃唑酮几乎不溶于水和乙醇 呋喃妥因几乎不溶于水 微溶于 乙醇 图1 1 四种硝基呋喃代谢物结构式 参考资料 这类抗生素因其具有抑菌性和杀菌性而广泛用于家禽 家畜 水产 蜂等 动物传染病的预防与治疗 部分品种具有促生长的作用 可用作饲料添加剂 呋喃类药物服后 吸收较少 吸收的部分在
6、体迅速被破坏 血药浓度低 不易 达到有效浓度 不宜用于全身感染的治疗 其中呋喃唑酮服后难吸收 肠中浓 度高而血中浓度低 故适用于各种肠道感染的治疗 呋喃唑酮可用于治疗小儿 菌痢 伤寒 消化性溃疡等疾病 呋喃唑酮的复方缓释制剂是卫生部批准的抗 HP HP是胃溃疡的主要致病菌 感染的药物 呋喃唑酮用于防治水生动物疾病 如用1 g kg 2 g kg防治观赏鱼蛀鳍烂尾病和罗非鱼溃烂病 呋喃唑酮用于 罗氏沼虾 鳗鲡 对虾和河蟹等水生动物养殖环境的消毒药物 呋喃唑酮用于 防治畜禽肠道感染 如兔球虫病 猪痢疾 禽白痢 火鸡黑头病等 2 呋喃妥 因服吸收较快 体消除快 此药由尿的排出量大 故主要用于治疗尿道
7、感染 而呋喃西林在本类药物中毒性最大 主要用作局部或创伤的感染的外用消毒剂 1 21 2 硝基呋喃类药物的危害及其管理对策硝基呋喃类药物的危害及其管理对策 1 2 1 硝基呋喃类药物的主要危害 1 对畜禽有毒性作用 大剂量或长时间应用硝基呋喃类药物均能对畜 禽产生毒性作用 其中呋喃西林的毒性最大 呋喃唑酮的毒性最小 为呋喃西 林的1 10左右 在硝基呋喃类药物中 以呋喃西林对家禽的毒性作用最常见 尤其是雏鸭和雏鸡 以220mg kg混饲喂雏鸭或以400mg kg混饲喂雏鸡 连续用 药10天以上 出现呆滞 羽毛蓬松 厌食或兴奋 惊厥症状 最后死亡 兽医 临床上经常出现有关猪 鸭 羊 鸽子等呋喃唑
8、酮中毒的事件报道 2 具有致癌致畸致突变 呋喃它酮为强致癌性药物 呋喃唑酮具中等 强度致癌性 通过对小白鼠和大白鼠的毒性研究表明 呋喃唑酮可以诱发乳腺 癌和支气管癌 并且有剂量反应关系 高剂量饲喂食用鱼和观赏鱼 可诱导鱼 的肝脏发生肿瘤 繁殖毒性结果表明 呋喃唑酮能减少精子的数量和胚胎的成 活率 硝基呋喃类化合物是直接致变剂 它不用附加外源性激活系统就可以引 起细菌的突变 3 代谢产物对人体危害严重 硝基呋喃类药物在体代谢迅速 代谢的 参考资料 部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态 结合态可长期保持稳定 从而 延缓药物在体的消除速度 用呋喃唑酮对种鸡进行处理以后 代谢物残留将按 种鸡 种蛋
9、 雏鸡 成鸡的生物链条传递 普通的食品加工方法 如烧烤 微波加 工 烹调等 难以使蛋白结合态呋喃唑酮残留物大量降解 这些代谢物可以在 弱酸性条件下从蛋白质中释放出来 因此 当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素 残留的食品 这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来 被人体吸收而对人类健康造成危害 动物肝脏为主要的药物代谢器官 蛋白质 结合态的残留药物主要累积在肝脏 1 2 2 硝基呋喃类药物的管理对策 由于硝基呋喃类药物残留危害严重 美国 日本和欧盟等国家和地区纷纷 采取措施 严加监管 欧盟 EU 从 1997 年开始将所有的硝基呋喃类抗生素全 部列为违禁药物 1990 年 7 月欧盟
10、颁布 2377 90 EEC 条例 将硝基呋喃类药物 及其代谢产物列为 A 类禁用药物 规定其在动物源性食品中的残留检测限为 1 0 g kg 3 由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑 自 1995 年起欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质 在动物源性食品中呋喃类残留物 的检出限为不得检出 欧盟 EU N0807 2001 法规中 规定使用 HPLC 方法检测 呋喃唑酮 检测限量 2ng kg 4ng kg 2004 年美国 FDA 公布了禁止在进口动物 源性食品中使用的 11 种药物 其中包括呋喃西林和呋喃唑酮 我国农业部文件农牧发 2002 号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限
11、为不得检出 美国 21CFR530 41 规定 食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥 因 韩国 2002 年版 食品公典 规定猪肉中不得检出呋喃唑酮 欧盟 EEC2377 90 规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃 包括呋喃唑酮 2002 年 4 月 我国农业部第 193 号公告 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单 将硝 基呋喃类药物列为禁止使用的药物 我国目前使用行业标准 SN0530 1996 出 口肉品中呋喃唑酮残留量检验方法 液相色谱法 检测限量 0 1 g kg 4 5 2003 年开始 我国将硝基呋喃纳入残留监控计划中 但是硝基呋喃类药物残留 超标事件时有发生 严重危及动物源性食品安全
12、和出口 因此 必须进一步强 化对硝基呋喃类药物的管理 参考资料 1 加强培训与宣传 提高安全用药意识 要广泛宣传畜禽健康养殖知 识 国家安全用药的有关法律法规和药物残留对人类健康的危害性 让广大养 殖者了解使用禁用药后产生的危害及法律后果 提高养殖者的法律意识和安全 用药的自觉性 2 加强兽药生产经营管理 严格按照兽药管理条例 兽药生产质量管 理规GMP和兽药经营管理规GSP的要求规生产经营行为 加大对生产 经营企业 的监督管理 严厉查处生产 经营禁用药的行为 3 加强饲料生产管理 加强对饲料生产企业的监控 严禁使用农业部 规定以外的兽药作为饲料添加剂 饲料生产企业要加强对生产原料的管理 做
13、到原料来源清楚 记录明确 要加强对原料检测 重点加强对鱼粉原料的检测 要防止含有硝基呋喃类药物的饲料原料投入生产 防止在生产过程中污染违禁 药物 4 加强畜禽养殖的管理 养殖过程是兽药残留监控的关键环节 养殖 者是动物源性食品安全的主体 其安全用药与否直接关系到食品安全 养殖场 应当建立养殖档案 载明饲料 饲料添加剂等投入品和兽药的来源 名称 使 用对象 时间和用量等有关情况 禁止使用硝基呋喃等违禁药物 5 加强兽药残留监控 加大投入 尽快建设完善我国动物源性食品的 兽药残留监控体系 形成国家 省 市 县完整的兽药残留检测网络梯级结构 加快我国兽药残留监控检测方法的研究步伐 发展简单快速准确灵
14、敏的分析技 术 加强对生产 加工和流通环节的监管 加大对养殖场 加工厂和农贸市场 等畜禽及产品的抽样检测力度 1 31 3 硝基呋喃类物质及其代谢物的样品处理方法硝基呋喃类物质及其代谢物的样品处理方法 样品的处理通常包括均质 提取 净化 衍生化等步骤 以达到释放残留 物特别是蛋白结合残留物 去除干扰基质 浓缩目标分析物的目的 1 3 1 样品的均质 取样时 通常仅取可食部分 并注意具有代表性 对于虾类样品的处理 先粉碎均匀 再冷冻储存 但对其他肌肉组织 肾脏和肝脏等样品 需要先冷 参考资料 冻 后选择有代表性部分切成薄片 再进一步粉碎 尽量避免将整个样品一次 均相 引起酶的活性增加 从而造成分
15、析物的损失 粉碎后的样品 用水 氯 化钠溶液或盐酸溶液混合均相 奶类和蜂蜜等样品的处理 可直接用水或盐酸 溶液混合均匀 1 3 2 提取和衍生化 1 3 2 1 溶剂提取 在样品的提取步骤 要求能够将动物性食品中的硝基呋喃残留物释放至溶 液中 一般使用水和酸化的有机溶剂 以达到去除大部分蛋白质和萃取残留物 的目的 在样品的提取和去蛋白过程中 有机溶剂也能从源性大分子中萃取非 共价键结合的残留物 常用的有机溶剂包括乙腈 乙酸乙脂 二氯甲烷等 除 此之外 三氯乙酸 甲醇 乙醇 二乙醚 Mcllvaine 缓冲溶液 甲醇 偏磷酸 甲醇 柠檬酸 磷酸氢二钠 氯仿 乙酸乙脂 二甲基亚砜都有应用的报道 1
16、 3 2 2 水解和衍生化 对于硝基呋喃代谢物的测定 鉴于其残留物主要以蛋白结合物形态存在 只有在适当的酸性条件下经水解过程 才能释放出游离代谢产物 而且因残留 物的浓度一般非常低 需要采用衍生化手段提高灵敏度 故样品的处理需要水 解和衍生化 通常水解选用稀盐酸 浓度为 0 1mol L 对衍生化试剂的选择 许多研究者对此进行了大量的探索 芳香醛类如 2 硝基苯甲醛 2 NBA 吡啶 3 羰基甲醛 2 4 二硝基苯甲醛 2 羟基 5 硝基苯甲醛和 2 氯苯甲醛 均 能与硝基呋喃游离代谢产物的自由氨基团反应 形成具有较好特性的芳香亚胺 类衍生物 2 NBA 是采用最多的衍生化试剂 该类衍生物在色谱柱上有较好的 保留 在质谱仪上有特征的离子碎片 灵敏度高 以呋喃唑酮为例 肌肉组织在酸性条件下被水解 产生游离代谢产物 AOZ 与 2 NBA 发生衍生化反应 生成性质稳定的衍生物 该衍生物有紫外吸收 并 可储存于 18 冰箱数周不变 同样地 呋喃西林 呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白结合代谢物 经酸水解 产生游离代谢产物 SEM AMOZ 和 AHD 参考资料 SEM AOZ AHD 和 AMOZ 的
