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1、 荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础 上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置 其主要组成 部件有三个 图 1 1 1 识别结合基团 R 能选择性地与被分析物 结合 并使传感器所处的化学环境发生改变 这种结合可以通过配位 键 氢键等作用实现 2 信号报告基团 发色团 F 把识别基团与 被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号 信 号报告基团起到了信息传输的作用 它把分子水平上发生的化学信息 转换成能够为人感知 颜色变化 或仪器检测的信号 荧光等 3 连接 基团 S 将信号报告基团和识别结合基团连接起来 根据设计的不 同连接基团可有多种选择 一般用做连
2、接基团的是亚甲基等短链烷 基 连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生 信号表 达可以是荧光的增强或减弱 光谱的移动 荧光寿命的变化等 图 1 1 荧光探针的结构 1 1 1 荧光探针的一般设计原理 1 结合型荧光探针 21 Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图 1 2 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接 起来的一类荧光探针 是比较常见的一类荧光探针 该类探针通过对 比加入分析物前后荧光强度的变化 光谱位置的移动或荧光寿命的改 变等实现对分析物的检测 在该
3、类荧光化学传感器的设计中 必须充 分考虑下列三个方面的因素 a 受体分子的荧光基团设计 合成 考虑到用于复杂环境体系的荧光检测 要求荧光基团要有强的荧光 高荧光量子产率 有利于提高检测的灵敏性 Stokes 位移要大 可 有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象 荧光发射 最好要在长波长区 最好位于500 nm 以上 可避免复杂体系的常位 于短波长区的背景荧光的干扰 另外由于长波长区发射的荧光能量的 降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命 b 受 体分子的识别基团 受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论 配位 作用以及超分子作用力 如氢键 范德华力等 作为理论指导 多选 择含
4、氮 硫 磷杂环化合物作为识别分子 c 荧光超分子受体的组 装 组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团 通过共价键连接在一起 要充分考虑到识别基团和荧光基团之间能通 过连接基进行信号传递 对识别对象的识别信息 如荧光的增强或减 弱 光谱的移动 荧光寿命的变化等 可以及时传递出去 N N N 1 图 1 3 共价连接型锌离子荧光探针 De Silva 在 1997 年报道的化合物 1 22 是一个典型的共价连接法 设计的荧光探针 它分别以有优良光学性质的蒽作为荧光基团 以对 Zn2 有特异性识别的基团双 2 吡啶甲基 氨 DPA 为识别基团 通过 亚甲基将识别基团和荧光报告基团连
5、接在一起 通过对比加锌前后荧 光强度的不同实现了对锌离子的检测 2 置换型荧光探针 图 1 4 置换型荧光探针 利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂 和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析物的检测 该类传感器对 识别基团和荧光指示剂的要求都比较高 既要选择能和识别基团结合 但结合能力又不是特别强的荧光指示剂 又要设计对被分析物能特异 识别的识别基团 该类设计方法多用于阴离子传感器的设计 2002 年 Kim 小组 23 设计了邻苯二酚紫作为荧光指示剂 双锌 配合物为 HPO42 识别基团 并将二者自组装成化合物2 用于中性 条件下水溶液中HPO42 的检测 加入识别客体HPO
6、42 后 由于 HPO42 与双锌配位能力强于邻苯二酚紫 从而把邻苯二酚紫挤开 使之进入溶液 表现为其原来颜色 在识别过程中 溶液颜色从蓝 色变为黄色 常见的Ac CO32 NO3 N3 ClO 4 S2 F Cl Br 都不影响HPO42 的检测 表现出较好的选择性 图 1 5 置换型 HPO42 化学传感器 3 化学计量型荧光探针 chemodosimeter 化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异 不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测 的一类探针 24 主要包括两种类型 一类是目标离子和探针分子发生 化学反应后仍旧通过共价键相连接 另一类是目标离子催
7、化了一个化 学反应 图 1 6 图 1 6 化学计量法的两种类型 一般而言 化学计量型荧光探针分子都具有专一性和不可逆性 尽管这类探针已有不少报道 但由于设计较为困难和反应不够灵敏等 缺陷而进展较为缓慢 3 4 图 1 7 氨基酸荧光分子探针 Kim 和 Hong 等 25 设计的识别半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光分子 探针 3 属于第一种类型 他们利用半胱氨酸及高半胱氨酸与醛生 成五元噻唑环或六元噻嗪环的特异反应以及反应前后化合物3和 4荧 光性质的显著差异实现了对半胱氨酸及高半胱氨酸的高选择性检测 化合物5 26 是较早应用化学反应原理实现检测客体的荧光探 针 属于第二种类型 化合物 5 的乙
8、腈溶液中加入汞离子后荧光显著 增强 34 倍 并红移 进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物6 5 6 图 1 8 基于汞脱硫原理的汞离子荧光探针 1 1 2 荧光分子探针的响应机理 目前 荧光分子探针的响应机理主要有以下几种 光致电子转移 PET photo induced electron transfer 分 子内电荷转移 ICT intramolecular charge transfer 荧光共振能量转移 FRET fluorescence resonance energy transfer 等 1 光诱导电子转移原理 PET 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后 激发态的电 子
9、给体与电子受体之间发生电子转移的过程 典型的光致电子转移荧 光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团R 通过连接基团S 和 荧光基团相连组成的功能分子 一般情况下 荧光分子探针的识别基团是电子给体 荧光基团是 电子受体 并且通常情况下多采用含有氨基的基团作为识别基团 具 体 PET 工作过程如下 在识别基团与待测物种结合之前 当荧光基 团受激发 具有给电子能力的识别基团能够使其处于最高占据轨道的 电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道 使被光激发的 电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光 导致荧光基团的荧光猝 灭 而识别基团与待测物种结合之后 由于降低了识别基团的给电子 能力 光致电子转
10、移过程被减弱或者不再发生 荧光基团的荧光发射 得到恢复 如图 1 9 Recepter Fluorophore linker 荧 光 基 团识 别 基 团 连 接 体 PET h exc h fluo a Recepter Fluorophore linker 荧 光 基 团识 别 基 团 连 接 体 PET h exch fluo b 图 1 9 荧光分子光致电子转移的 开 光 过程示意图 由于与待测物种结合前后的荧光强度差别很大 呈现明显的 关 开 状态 因此这类荧光分子探针又被称为荧光分子开关 PET 荧光分子探针的作用机制可由前线轨道理论 2 来进一步说明 见图 1 10 从图可以看出
11、 识别基团处于自由态时 其HOMO 轨道上的 电子可以向荧光基团的HOMO 轨道上转移 致使荧光基团被激发到 LUMO上的激发态电子不能返回基态而难以产生荧光 此过程对应 于发生PET 现象 在识别基团与待测物种结合后 识别基团上的 HOMO 电子已无法转移到荧光基团的HOMO 轨道上 使 PET 过程无 法进行 这时荧光基团的激发态电子可以返回基态 产生荧光 由此 可见 利用识别基团对PET 过程的控制可以实现对体系荧光发射状 态的调控 荧光团结合受体前荧光团结合受体后 图 1 10 光致电子转移机制机制的前线轨道理论解释 化合物 1 是一个非常典型的PET 机理荧光增强型的例子 锌离 子不
12、存在时 由于识别基团中氮原子上的孤对电子能够在荧光基团受 激发态时占据激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道 使被光激 发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光 导致荧光基团的荧光 猝灭 即发生了光致电子转移 PET 当 Zn 2 存在时 Zn2 离子与 两个吡啶氮及氨基配位 束缚了氮上的孤对电子 使发生在氮原子和 荧光团之间的PET 过程被禁阻 荧光强度大幅度增强 实验结果也 证实了此过程 在乙腈溶液中 加入Zn2 离子之前 化合物1 的荧 光量子产率仅为0 01 加入 Zn2 离子之后 它的荧光量子产率为0 77 荧光增强了 77 倍 2 分子内电荷转移 ICT 机理 分子内电荷转移荧光探
13、针分子通常由富电子基团 电子给体 和 缺电子基团 电子受体 共轭相连 形成推 拉作用的共轭体系 没 有 PET 探针分子那样明显的连接基 也就是说荧光团F 和受体 R 通 常融合在一起 识别过程二者同时参与 当受体结合被分析物后 作 为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力被改变 整个共轭 体系的电荷重新分布 荧光团的推 拉作用被抑制或强化 进而导 致吸收光谱 激发光谱以致发射光谱发生红移或蓝移 如图 1 11 27 化合物 7 28 两端分别含有羰基 苯并噻唑两个强拉电子基和两个 氨基强供电子基团 激态时荧光团能够有效地实现了从供体到受体的 整个体系电荷分离 是典型的 ICT 机理的荧光
14、分子探针 当汞离子 存在时 四氨基识别基团捕获Hg2 离子 6 7 位氮的供电子能力大大 减弱 减弱了整个体系电荷分离程度 引起吸收波谱和荧光光谱分 别蓝移了 60 nm 和 92 nm 荧光颜色由蓝色变为黄色 同时实现了 比色及比率型 Hg2 离子的检测 图 1 11 识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT 过程光谱移 动示意图 7 8 图 1 12 具有 D A 结构的 ICT 汞离子荧光探针 3 荧光共振能量转移 FRET 机理 荧光共振能量转移是指当一对合适的能量给体分子 Donor 和受 体分子 Acceptor 相距一定距离 一般为 2 5 nm 且给体的发射光谱与 受体的吸收光
15、谱能有效重叠时 处于激发态的给体将把一部分或全部 能量转移给受体 使接受体被激发的过程 受体可以是荧光物质也可 以是只有吸收而没有发射的荧光猝灭剂 根据F rster 理论 共振能 量转移效率可以用式1 5 表示 29 6 0 1 1 R R T 1 5 式中 R为两个荧光基团的距离 R0为 F rster 距离 供体 受体之间的 临界转移距离 从这个方程可以看出 即使R 的微小变化都会导致 能量转移的效率强烈改变 24 26 9 10 图 1 13具有 D A 结构的 FRET 汞离子分子荧光探针 利用 FRET 效率对距离的强的依赖性 FRET 广泛应用于蛋白质 和核酸的结构及动力学研究 分子结合的测定等领域 30 同样 能量 共振转移原理也被用于荧光分子探针的设计 2004 年 Ono 小组 31 设计了以荧光素为能量供体 以没有发射 的荧光猝灭剂 4 4 二甲氨苯偶氮 苯甲酰基为受体 二者通过富含胸 腺嘧啶的碱基连接在一起 当加入汞离子之前 供体受体之间的距离 较长 二者不会发生能量共振转移 只发射荧光素的荧光 当加入识 别客体 Hg2 后 含有多个T 的碱基发生特异性分子识别 拉近了荧 光素和 4 4 二甲氨苯偶氮 苯甲酰基间的距离 发生荧光素向 4 4 二 甲氨苯偶氮 苯甲酰基的能量转移 从而猝灭荧光素的荧光
