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1、生物梅里埃公司 将质谱技术实现于临床细菌检测和鉴定的常规分析 2 现代微生物的分类 蛋白质组及基因组 质量指纹图谱基因指纹图谱 什么是质谱MassSpectrometry 定义 用电场和磁场将运动的离子 带电荷的原子 分子或分子碎片 按它们的质荷比分离后进行检测的方法 20世纪初 J J Thomson创制了抛物线质谱装置 阴极射线在电场作用下发生偏转 质谱仪简单构造 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 基本构造及功能 高真空系统 首先 在离子源中 使分子离子化 其次 带电分子的离子及其碎片必须根据其质荷比来得到分离 这往往在质量分析器中进行 最后 分离的带电荷的碎片必须通过检测器检测 离子
2、源分类 用于同位素质谱 无机物质谱 有机物质谱的电离方式电子轰击电离 electronimpact EI 化学电离 Chemicalionization CI 大气压化学电离 atmosphericpressurechemicalionization APCI 然而以上电离方式产生的能量传输容易导致蛋白质破碎 故不适用于生命科学 离子源分类 诞生于20世纪80年代的软电离技术 具有高灵敏度和高质量检测范围 使得在pmol 10 12甚至fmol 10 15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能 从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域电喷雾电离 Electrospray
3、ionization ESI 快原子轰击 Fastatombombardment FAB 基质辅助激光解吸电离质谱技术MALDI TOF MatrixAssistedLaserDesorption Ionisation TimeofFlight 最柔软的电离方式保证完整分子量信息 例如蛋白质 多肽 直接从细菌核糖体中筛选蛋白质 一般都使用飞行时间检测器 TimeofFlight 来检测 故名 MALDI的原理和特点 最新 柔软 电离技术 它允许完整检测生物分子原理如下 将分析物分散在基质分子中并形成晶体 当用激光照射晶体时 由于基质分子经辐射所吸收的能量 导致能量蓄积并迅速产热 从而使基质晶体
4、升华 致使基质和分析物膨胀并进入气相广泛的质量范围质谱图多为单电荷离子 因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系 可以鉴定混合菌种 但需要先提纯高灵敏度 1000CFU 高分辨率和质量图谱更准确 诞生过程 梅里埃的承诺 2009 bMx internalmassspecdevelopments收集所有的菌种 建立临床应用的细菌数据库May2010 收购SARAMIS细菌数据库 2000个菌种 60000谱 June2010 与合作Co developmenttooptimizemassspectrometryformicrobiologylaboratoriesShimadzu发明
5、MALDI TOF 微生物体外诊断领导者 知识产权 欧洲共同体专利EU1253622 E1MethodofidentifyingmicroorganismsusingMALDI TOF MSGrantedDecember2007 利用MADLI TOF质谱鉴定微生物 1987 Shimadzu sKoichiTanakaintroduceshiscobalt glycerolmatrixforMALDIinTakarazukaJapan2002年 田中耕一获得诺贝尔化学奖 与MALDI发明家合作开发 原理示意图 简单工作流程 步骤1 步骤2加入基质 步骤4上机 步骤5开始读数及分析 样品靶 细
6、菌 霉菌 酵母 分枝杆菌的菌落 步骤3空气干燥几分钟 MALDI原理示意图 1 激光 样品 A 与基质 M 样品靶 用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜过程中将质子转移到生物分子MH A M AH 基质附助激光解吸电离离子源 MALDI TOF飞行时间质量分析器 2 Lineartime of flightmassspectrometer lmassrangeupto500kDa TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道 根据到达检测器的飞行时间不同而被检测离子的质荷比 M Z 离子的飞行时间成正比 飞行时间的结果会显示在示波镜和电脑上 离子检测器 3 17 MALDI TOFMSata
7、glance 工作流程 今天具备 主要组合样品准备工作站VITEKMS主机 MALDI TOF 数据采集工作站Myla 连接LIS 为感染治疗服务的质谱系统 标本准备工作 direct additionof 1 0 Lmatrixsolution solventevaporation atroomtemperature automated MSanalysis MALDItarget 样品板 低成本 每块样品板有条形码 48个检测孔及3个对照 可以分开3次使用 即每16个测试包含1个质控 商品化的试剂 高通量 4位技师同步准备4x48spots 192标本 批可追溯性及内部质控节省时间 速度快
8、 以 分钟 计 1分钟完成1 2菌株鉴定 VITEKMS标本准备工作站 可追溯性扫描样本板条码输入每个标本号码整合VITEK2AST VITEKMS数据采集工作站 实时显示实验进程提示需要重新测试的样品 VITEKMS数据采集工作站 VITEKMS检测核糖体蛋白质 重复性高 检测固定表达的高含量蛋如核糖体蛋白宽泛的质量范围2000 20000道尔顿 TheribosomeofE colihasabout22proteinsinthesmallsubunit labelledS1toS22 and34proteinsinthelargesubunit L1toL36 质控菌株ATCC8739E
9、colicells ForE coliK12strainsanumberofexactaverageproteinmassesareknownthatareusedascalibrants 细菌质量指纹图谱 扩展到新的菌种和应用 用户不断增加细菌数据库 检测细菌的核糖体蛋白不同波形代表不同菌种 MylaTM主脑 Myla VITEKMS状态 Myla VITEKMS结果分析 Myla VITEKMS结果分析 VITEKMS Myla MylaTM服务器 VITEKMS数据处理分析 准备工作站 VITEK2ID AST LIS 工作流程 信息流程 BacT Alert 强大的菌种库供您选择 VI
10、TEK MSRUO 科研用途Saramis数据库2000 菌种临床环境 VITEK MS 体外诊断利用MYLA连接鉴定及药敏检测近800临床菌种细菌酵母菌 霉菌 皮肤癣菌分枝杆菌 VITEK MS体外诊断菌种库 临床菌种覆盖一般细菌酵母 霉菌分枝杆菌覆盖了微生物学实验室出现的大多数菌种大中华区菌种库合作计划 开启微生物研究新时代 临床微生物常规鉴定 现在情况 细菌和酵母菌株的鉴定主要是根据表型试验包括革兰氏染色 培养和生长特性和生化试验 可靠的方法但耗时 鉴定结果在第二天 需要更快的鉴定结果以改善病人护理和提供适当抗生素疗法 MALDI TOFMS 质的飞跃 轻松 快速诊断人类病原体证明是一个
11、可靠和快速的方法 进行中的革命性改变 在几分钟内得到鉴定结果 关键信息做药敏试验 MALDI TOFMS 鉴定某些重要微生物具有明显优势 酵母菌传统方法 比较难以确定及耗时非常简单从培养基挑选菌落 MALDI TOFMS 分枝杆菌生长时间 不同菌种 时间不同使用MALDI TOFMS 更快 更便宜的分子方法中和步骤需要BSL3阳性血培养瓶非常关键快速鉴定血液感染的微生物传统方法 传代 检测 鉴定结果需要最小24小时后MALDI TOFMS 提纯步骤MALDI TOFMS 鉴定病原最少快1天 优势 更简单 无需革兰染色更灵活 所有的微生物只需简单样品制备 即可鉴定更准确 满足临床 科研的需要样板
12、板有可追溯条形码 ISO15189 更快速 出结果时间以 分钟 计高通量 可同时检测192个样本低成本 功能评估 1 JCM Apr2010720clinicalisolatestestedSARAMISresultfor639isolates99 4 correctBrukerresultfor680isolates99 1 correct 功能评估 2 Sept20101021clinicalisolatestestedSARAMIS 98 correctID sPhoenix 90 correctID sAdditional138rareclinicalstrainstestedSARA
13、MIS76 concordantIDwithPhoenixand or16SAssuminglyremainingstrainsnoID incorrectIDnotmentioned 比Phoenix准确度更高 稳健性 MassspectraofProteusmirabilisDSM4479grownonColumbiaagar Majormasssignalsarestillrecordedafter120hincubation SARAMISidentificationsuccessfulforallincubationtimes Noinfluenceofincubationtimeoverawidespan 不受培养时间的影响 MassspectraofEnterobacteraerogenesDSM30053grownonthreedifferentstandardmediafor24h Majormasssignalsarerecordedinallsamples SARAMISidentificationsuccessfulforallgrowthmedia Noinfluenceofgrowthmediumonidentification 不受培养基的影响 稳健性 Mylaatwork 如果有一天 谢谢
