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1、 荧光定量PCR应用 相对定量胡顺磊18640128781 2 相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结 3 PCR定量实验概述 相对定量 4 相对定量PCR实验目的和要求 相对定量实验的目的是用于研究样本中某个或某些核酸表达水平的差异 优点 能够检测目的基因 量 的细微变化长期实验及不同实验体系中所得数据能够进行比较 5 相对定量原理 I 利用内参基因 内源性对照 对样本间的差异进行归一化处理 Step1 相同样品中的目标基因和参比基因的浓度Step2 不同样品中目的基因的含量差别由参比基因校正 参比基因可以修正 样品起始量的差别样品中核酸回收率的差别样品中可能的RNA降解不
2、同样品中核酸质量的差别加样差 参比基因的选择 理想的参比基因 表达水平在所有样品中是持续 稳定的 正常组织vs 肿瘤组织表达水平不受实验条件变化的影响 处理样本vs 未处理的样本看家基因 Housekeepinggenes 编码有基础细胞功能的蛋白质 7 ReferenceGeneSelection Normalizationofgeneexpressionmeasurementsintumortissues comparisonof13endogenouscontrolgenesdeKokJB RoelofsRW GiesendorfBA PenningsJL WaasET FeuthT S
3、winkelsDW SpanPN LabInvest 200585 1 154 159ReferencegenesidentifiedinSH SY5Ycellsusingcustom madegenearrayswithvalidationbyqPCRHoerndliFJ ToigoM SchildA GotzJ DayPJ AnalBiochem 2004335 1 30 41DeterminationofaninternalcontroltoapplyreversetranscriptionquantitativePCRtostudystressresponseinthelacticac
4、idbacteriumOenococcusoeni DesrocheN BeltramoC GuzzoJ JMicrobiolMethods 200560 3 325 33 Evaluationofpotentialreferencegenesinreal timeRT PCRstudiesofAtlanticsalmon OlsvikPA LieKK JordalAE NilsenTO HordvikI BMCMolBiol 2005Nov17 6 21 Selectionofreferencegenesforquantitativereal timePCRinbovinepreimplan
5、tationembryos GoossensK VanPouckeM VanSoomA VandesompeleJ VanZeverenA PeelmanLJ BMCDevBiol 20055 27 使用校准品样本 calibrator 对最终分析结果进行进一步的均一化校准同次实验中目的基因与参比基因的检测灵敏度校正不同次实验间runtorun 不同试剂批号lottolot差异 相对定量原理 II 校准品样本 未处理的细胞系起始时间点的样本正常组织样本 9 相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结 相对定量常规的两种分析模式 相对定量 以校正样本归一化处理 精确值 带扩增效率校
6、正 method 近似值 没有扩增效率校正 CT法 全部假设 E 2 相对定量计算公式 2 CT 相对定量计算公式 ETCpT C CpT S XERCpR S CpR C 校正目标基因和内参基因实际上不同的扩增效率 11 PCR定量实验 E N NoxECp 相对定量结果的计算方法 EFFICIENCY扩增效率ET ER 2 相对定量方法 1 Cp法 默认扩增效率E 2 Cp 方法CalibratorNormalizedRatio 2CpT C CpT S x2CpR S CpR C 2 CpT C CpR C CpT S CpR S 2 Cp C Cp S 2 Cp 相对定量方法 1 Cp
7、法 该方法假设 目标基因和内参基因的PCR扩增效率相同扩增过程在整个PCR反应中保持恒定不变 E 2 归一化的相对比率 2 Cp无需标准曲线 PCR扩增效率的影响因素 目标基因和内参基因之间的PCR效率差异是由于 探针复性的差异染料淬灭系数的差异荧光共振能量传递效应 FRET 的效率差异cDNA合成效率的差异目标基因与内参基因之间的PCR效率差异会造成实验的显著误差当前有且仅有LightCycler相对定量软件的独特算法可对效率差异进行校正 实际上 不是所有的PCR反应都能达到E 2的理想扩增效率不是所有的PCR反应在整个过程中的扩增效率都保持恒定 PCR扩增效率 PCR扩增效率的差异存在于
8、不同模板及引物序列的差异不同的PCR体系不同次的PCR实验N NoxEn E 2 理想情况下扩增效率 2 17 PCR扩增效率的计算 E 10 1 slope 相对定量方法 2 Method 通过标准曲线对扩增效率修正标准曲线对样品做梯度稀释不需要已知样品浓度 最为准确的相对定量结果 相对定量方法 2 Method 扩增效率的校正显著降低了计算中的误差 Method是罗氏诊断的独有算法 采用产物的实际扩增效率数值计算定量结果 校准样本校准后的浓度比 ETCpT C CpT S XERCpR S CpR C 20 相对定量的原理相对定量实验的分析方法LightCycler Software操作相
9、对定量实验设计总结 21 LightCycler 480Software1 5相对定量 分析模块 两种不同的分析方法 简单相对定量分析 简洁 自动 结果通过一键即可自动计算获得高级相对定量分析 根据您的需要 提供更为灵活且可靠的分析结果 22 LightCycler 480Software1 5初始界面 NewExperimentfromTemplate Selectappropriaterunprotocole g fordetectionofFAM MonoColorHydrolysisProbe UPLProbe 23 LightCycler 480Software1 5SampleEd
10、itor TableorPlateViewStep1 SelectWorkflowandFilterCombinationStep2 SelectSamplesStep3 Enterpropertiesanddefineidentifiers 24 自动配对 分析软件可以根据SampleEditor中样本的名字进行目的基因和内参基因的配对 LightCycler 480Software1 5相对定量实验涉及到的标识 25 简单相对定量分析WithOneClicktoResults 26 简单相对定量分析注意事项 简单相对定量分析模式默认是将整板的孔信息进行分析 将未使用的孔设置为Unassig
11、ned 简单相对定量分析模式默人使用FitPointsmethod计算Cp值 因此可能需要进行NoiseBand的设定 点选TargetName 激活所指定的target点击ShowAbsQuant调整NoiseBand点击Calculate点击BacktoRelQuant 27 高级相对定两分析可以根据您的需要进行更多灵活的分析 28 高级相对定量分析结果 柱状图 29 高级相对定量分析手动配对 30 相对定两分析软件中的Factors OptionalMultiplicationFactor Amultiplicationfactormightbeusedtoadjustthefinalc
12、alibrator normalizedrelativeratiostoareasonablevalue cosmetic functionforeasierreadingandinterpretationofresults CorrectionFactor Afactorthatisusedtonormalizeforlot to lotdifferencesofthecalibrator Eachnewbatchofthecalibratorhastobevalidatedwitha master calibrator 31 高级相对定量分析TargetName 选中目的基因的名字然后点击
13、ShowAbsQuant查看并调整相关基因的扩增结果CrossingPointsResultsReplicateStatisticsDisplayEfficiency 32 高级相对定量分析Results SampleView 33 高级相对定量分析Result Settings 34 LightCycler 480Software1 5Report 35 相对定两分析模块BasicandAdvanced AnalysisOptions 36 相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结 37 相对定量实验设计 主要因素 1 实验设计确定研究的目的基因选定合适的内参基因 最好能多选
14、取几个 优化反应条件选择合适的样本及样本制备方法 包括对照样本的选取 2 实验验证确定实验的效果 动态范围 效率 3 分析方法的选择简单相对定量分析高级相对定量分析 38 一步法or二步法RT PCR One StepRT PCR 逆转录 PCR扩增过程一次完成操作简单污染几率低快速引物的特异性要求高Two StepRT PCR 逆转录和PCR扩增分别完成不同的引物选择 oligodT randomhexamers specific cDNA便于长期保存 39 目的基因 内参基因扩增方式的设计 目的基因和内参基因分别在不同的反应管中扩增 表达水平差异很大目的基因和内参基因通过不同的run扩增
15、PCR反应程序不同 不同的检测模式 e g SYBRGreenI andreference e g HybProbeformat 目的基因和内参基因进行多重PCR扩增 dualcolor 多重荧光扩增会降低动力学范围 比较单色扩增和双色扩增时目的基因与内参基因的动力学范围 40 CalibratorNormalizedRelativeQuantification设置 无扩增效率校正 E 2 简单方法有扩增效率校正 高级相对定量 双标法 效率 影响因子 Determinationofacorrectionfactorand oramultiplicationfactor 单色 目的基因和内参基因
16、在不同的反应管或反应孔 双色 目的基因和内参基因在同一个的反应管或反应孔 flexible Pairing oftargetandreferencesamples multiplehousekeepinggenes 反应的设置 校准样本 选择合适的校准样本 41 LightCycler 相对定量分析Workflow EstablishedLightCycler PCRfortargetandreferencegene Determinationofacalibrator LCrunwithsamplesandcalibrator target reference Analysis Basic Advanced 42 相对定量实验设计WorkflowExample 1 1 ExperimentDesignIdentificationofthetargetgene s ofinterestandsuitablereferencegene s e g target1 target2housekeepinggene HK 1 housekeepinggene HK 2Optimizationo
