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1、专题二 微生物的培养与应用课题：微生物的实验室培养【本节目标解读】【课程目标】了解培养基的基础知识，进行微生物培养和无菌技术的操作。【课题重点】无菌技术的操作【课题难点】无菌技术的操作【基础知识】一、培养基1概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基。可分为 培养基和 培养基。 2分类方式：分类标准类 型备 注培养基的 培养基、 培养基和半固体培养基培养基中加入凝固剂（有琼脂、明胶、硅胶等）即为培养基。 培养基实验室中最常用的培养基之一微生物的种类细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养培养基的特殊用途基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基选择培养基：允
2、许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。如鉴别大肠杆菌的伊红美蓝培养基，鉴别纤维素分解菌的刚果红培养基。3营养构成：各种培养基一般都含有 、 、 和 ，此外还要满足微生物生长对 、 以及 的要求。 4培养乳酸杆菌时需在培养基中添加 、培养霉菌时需将培养基PH调至 、培养细菌时需将PH调至 、培养厌氧微生物则需提供 条件。5E.coli指 。思考1从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？【补充】碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和
3、分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。二、无菌技术：1关键 防止 的入侵。围绕如何避免杂菌的污染展开。2无菌技术（1）对实验操作的 、操作者的 和 进行 。（2）将用于微生物培养的 、 和 等器具进行 。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 相接触。思考2无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是什么？3比较消毒和灭菌消 毒灭 菌概念用较 的物理或化学方法杀死物体的 部分微生物（不包括
4、芽孢和孢子）用较 的理化因素杀死物体 微生物（包括芽孢和孢子）常用方法 消毒法（ 消毒法）、 消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、 灭菌、 灭菌适用对象操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等思考3利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是什么？思考4物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是 ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 ，温度为 ，并维持 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 时打开锅盖，其目的是防止 。三、实验操作（大肠杆菌的纯化培养）（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1计算：根据 比例，计算100mL培养基各成
5、分用量。2称量：牛肉膏较黏稠，可用玻棒挑取，同 一同称量。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。3溶化：加水加热熔化牛肉膏与称量纸取出称量纸加入蛋白胨和氯化钠继续加热加入 用蒸馏水定容到100mL（整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂）。4灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用 灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用 箱灭菌。5倒平板：待培养基冷却至 左右时在 附近操作进行。其过程是：在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固
6、后，将平板倒过来放置。思考5在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的称量操作中，动作要迅速，原因是什么？溶化操作中需要不断用玻璃棒搅拌的目的是什么？思考6牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供什么等营养物质？思考7锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是什么？思考8倒平板的目的是什么？思考9若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？思考10配制斜面培养基作用是什么？，试管为什么要加塞棉塞？（二）纯化大肠杆菌1方法：微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧
7、红。在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划35条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。将平板倒置放在培养箱中培养。思考11取菌种前灼烧接种环的目的是什么？为什么除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环？取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是？最后灼烧接种环的目的是？在第1次划线
8、后都从上次划线末端开始的目的是？（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。思考12系列稀释操作的注意事项是什么？思考13涂布平板操作的步骤是什么？2培养：将接种后的培养基和一个 的培养基都放入 恒温箱中，培养12h和24h后喷喷别观察并记录
9、结果。（三）菌种保藏：频繁使用的菌种利用 法保存，长期保存菌种的方法是 法。（四）结果分析与评价1培养未接种培养基的作用是什么？，若有菌落形成，说明什么？2在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落颜色？形态？3培养12h和24h后的菌落大小？ ；菌落分布位置？ ，原因？ 思考14在某培养基上出现了3种特征不同的菌落是什么原因？思考15频繁使用的菌种利用什么法保存？长期保存菌种的方法是什么？【知识拓展】1、消毒与灭菌的区别 消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。例如一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱
10、油等进行消毒处理的巴氏消毒法，等等。 灭菌是采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。2、微生物的营养类型我们研究微生物的营养、代谢和生长要把病毒排除在外，因为病毒是分子生物，自己不能独立进行代谢，只能专性活细胞内寄生，而其他微生物的营养、代谢和生长却有共同之处。（一）微生物需要的营养物质及功能分析微生物细胞的化学组成，可以大致了解微生物需要的营养物质。微生物的化学组成与其他生物的大体相同，也是由C、H、O、N、P、S以及其它元素组成，其中C、H、O、N占细胞干重的90以上。组成微生物的化学元素分别来自微生物生长所需的营养物质，营养物质
11、按照它们在机体中的生理作用，将它们区分为碳源、氮源、生长因子、水和无机盐等五大类。各类营养物质都有一定的功能，不同代谢类型的生物所需营养物质、类型不同。1碳源与氮源概念来源最常用来源作用说明碳源凡能为微生物提供所需碳元素的营养物质无机碳源：CO2、HaHCO3等有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类尤其是葡萄糖主要是用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物异养微生物的主要能源物质不同种类的微生物，对碳源需要差别大，例：甲基营养菌：只利用甲醇、甲烷假单孢菌：利用90多种含碳化合物氮源凡能为微生物提供所需氮元素的营养物质无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸
12、等铵盐、硝酸盐主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物异养微生物：含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源（1）自养微生物和异养微生物的碳源不同：自养微生物以CO2或碳酸盐为惟一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。（2）自养微生物和异养微生物的能量来源也有所不同：自养微生物生命活动所需能源：一种类型是利用光能，如蓝细菌等着色细菌；一种类型是依靠物质氧化过程释放能量，如硝化细菌；异养微生物生命活动所需的能源主要依靠物质氧化分解放能，碳源是异养微生物的主要能源物质，即碳源，对于异养微生物来说，不仅可为机体提供构成细胞的物质，而且为机体提供完成整个生理活动所需的能量；某
13、些异养微生物也可以以光能作为能源，例如红螺菌，它不能以CO2作为主要或惟一碳源，而需要有机物参与，才能利用光能将CO2还原成细胞物质，有人将这种营养类型称为光能异养型。实际上，红螺菌在不同条件下生长时，其营养类型会发生改变。有没有有机物的条件下，它又可以利用有机物进行生长，所以，红螺菌是一种典型的兼性营养型细菌。（3）依据微生物生长所需碳源物质的性质以及生长所需能源，将微生物的营养类型归纳如下表所示：营养类型主要（或惟一）碳源能源代表菌光能自养型CO2光能蓝细菌光能异养型有机物光能红螺菌化能自养型CO2无机物硝化细菌化能异养型有机物有机物大肠杆菌（4）利用某些微生物碳源的特殊性可以解决的实际问题：利用细菌个别种类、放线菌、酵母菌以石油作为碳源的原理，消除石油污染；
