(精编资料推荐)外周血的NK细胞分离培养

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1、专业资料推荐外周血的NK细胞分离培养1. 样本采集常规操作采集患者外周血,避免样本污染。2. 细胞分离超净工作台中,分装血样于50mL离心管中,取全血样1mL计数(3mL全血留样)。2000rpm离心10min,取上层血浆于50mL离心管(1.5mL未灭活血浆留样)。56灭活30min,3000rpm离心10min,去沉淀后4保存上清。生理盐水1:1稀释混匀血细胞,缓慢加到装有Ficill的离心管内(界面清晰,血样:Ficoll不超过2:1),1600rpm离心20min。吸弃上清,吸取白膜层到离心管,加生理盐水至45mL,混匀后1500rpm离心10min。吸弃上清,生理盐水重悬后合并一管,

2、加生理盐水至45mL。混匀,取样计数计算细胞总量,1800rpm离心10min。参照试剂盒说明书配置培养液、滋养细胞液。3. 细胞培养(山东齐鲁细胞治疗NK细胞培养试剂盒)0d,T75培养瓶接种:30mL细胞悬液+NK-1试剂2+5%自体血浆,37,5.0%CO2培养箱培养。(接种密度1.0-1.5*106/mL)3d,离心换液:T75培养瓶中细胞转移至50ml离心管1600 rpm/min升6降4离心10min去除上清。细胞沉淀+NK细胞培养液(30mL)+5%自体血浆于新T75培养瓶。5d,转移到T175培养瓶,细胞状态好,加培养液到50mL(5%自体血浆)。6d,观察细胞,细胞状态好,加

3、培养液到120mL(5%自体血浆)。7d,观察细胞长势,装袋并添加1支NK-2试剂2,加培养液到220mL(1%自体血浆),菌检。8d,加培养液到500mL(1%自体血浆)。9d,加培养液到1000mL(1%自体血浆)。10d,加培养液到1400mL(1%自体血浆)。11d,加培养液到1600mL(1%自体血浆)。12d,加培养液到1800mL(1%自体血浆)。13/15d,根据细胞长势及临床安排收获细胞。计数计活及流式检测。1:NK细胞培养液:1支D试剂、1支E试剂溶解到1瓶C试剂中。2:NK-1、NK-2试剂为滋养细胞,须严格按照常规细胞的保存及复苏标准操作,使用前需离心去除上清才能共培养。预实验数据:第8天第9天第10天第11天第12天第13天第14天第15天计数结果(109/mL)0.80.50.30.20.1计活结果(%)1001001001001002

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