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1、基础知识考前最后梳理（5）三、多聚酶链式反应扩增DNA片段1PCR：多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2扩增方向：总是从子链的5端向3端延伸。3需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从引物3端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。4原理：热变性原理，5条件：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，脱氧核苷酸，耐热的Taq DNA聚合酶，同时控制温度。6过程：变性（高温 94）、复性（低温55）、延伸（中温72）7结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于两引物之间的DNA序列，使这段固定长
2、度的序列呈指数扩增。四、血红蛋白的提取和分离1、实验原理：利用蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力，分离不同种类的蛋白质。2、凝胶色谱法原理：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量小的分子要穿过多孔凝胶颗粒的内部通道，路程长，流动慢；相对分子质量大的分子直接通过凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快。第十单元 现代生物科技一、基因工程1. 基因工程的诞生（1）基因工程：按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。（2）基因工程诞生的理论基础是在
3、生物化学、分子生物学和微生物学科的基础上发展起来，技术支持有基因转移载体的发现、工具酶的发现，DNA 合成和测序仪技术的发明等。2.基因工程的原理及技术(3)基因工程操作中用到了限制酶、DNA 连接酶、运载体考点限制酶细化：限制酶主要从原核生物生物中分离纯化出来，这种酶在原核生物中的作用是识别 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 限制酶的特性是识别特定核苷酸序列，切割特定切点。限制酶产生的末端有两种：粘性末端和平末端。 DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的作用部位是磷酸二酯键，二者在作用上的区别为前者是恢复被限制性内切酶切开的两个核苷酸之间的磷
4、酸二酯键，后者单个的核苷酸连接到DNA分子上。 作为基因工程的载体应该具备标记基因、多个限制性内切酶切点、能够在宿主细胞内复制和稳定存等特点。 常见的载体种类有质粒、动植物病毒、噬菌体（4）基因工程四步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达。考点细化： 目的基因的获取方法为根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在载体上的位置、基因的转录产物、以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 基因文库、基因组文库、cDNA 文库的区别：含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌体分别含有这种生物的不同基因，称之为基因文库
5、。如果含有一种生物所有基因，叫做基因组文库。只包含一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA 文库。 基因重组操作中构建基因表达载体的目的是将目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时目的基因能够表达和发挥作用。 一个完整的基因表达载体包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因。 将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的常用方法分别是脓杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法。 基因工程的受体细胞选择，植物可以采用体细胞，动物不能用体细胞，一般采用受精卵细胞。因为受精卵具有全能性。 当受体细胞是大肠杆菌时常用Ca2+处理细胞，这样做的目的是使细胞处于一种能够吸收
6、周围环境中的DNA 分子的感受态细胞。 目的基因的检测：转基因生物的 DNA 是否插入了目的基因（DNA分子杂交技术）；目的基因是否转录出了 mRNA（分子杂交技术）；目的基因是否翻译成蛋白质（抗原-抗体杂交）；个体生物学水平鉴定。 目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因的检测和表达一般需要碱基互补配对。将目的基因导入受体细胞不需要碱基互补配对3. 基因工程的应用（5）在农业生产上：主要用于提高农作物的抗逆能力（如：抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等），以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。（6）基因治疗不是对患病基因的修复，基因检测所用的 DNA 分子只有处理为单链才能与被
7、检测的样品，按碱基配对原则进行杂交。4. 蛋白质工程（7）蛋白质工程的本质是通过基因改造或基因合成，对先有蛋白质进行改造或制造新的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程；基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质二、克隆技术1. 植物的组织培养（1）细胞工程：指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或者细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获取细胞产品的一门综合科学技术。在细胞器水平上改变细胞的遗传物质，属于细胞工程。（2）细胞全能性：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。考点细化： 都具有该生物全部遗传信息，因此从理论上讲，
8、生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 细胞在生物体内没有表现出全能性的原因是基因选择性表达。 植物细胞的全能性得以实现的条件是离体，合适的营养和激素，无菌操作。 在生物的所有的细胞中，受精卵细胞的全能性最高。（3）植物组织培养：在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。考点细化： 已分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程叫脱分化。 再分化是愈伤组织继续进行培养，重新分化出根或芽等器官。 愈伤组织细胞排列疏松而无规则，高度液泡化的呈不定型状态的薄壁细胞。 植物
9、组织培养时培养基的成分有矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加物，与动物细胞培养相比需要蔗糖、植物激素，不需要动物血清。 在植物组织培养脱分化过程中，需要植物激素 植物组织培养全过程中都需要无菌，愈伤组织之前不需要光照（4）植物组织培养技术的用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。考点细化： 用植物体的茎尖、根尖来获得无病毒植物人工种子中人工胚乳相当于大豆种子的子叶，人工种子与正常种子相比发芽率高。 转基因植物的培育需要植物组织培养（5）将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体叫做植物体细胞杂交。考点细化： 用纤维素酶
10、、果胶酶去除细胞壁获得原生质体 物理方法：点刺激、振荡、离心；化学方法：聚乙二醇 植物体细胞杂交完成的标志是新细胞壁的形成 融合后的杂种细胞通过植物组织培养才能发育成完整的植物体（6）植物体细胞杂交这一育种方法的最大优点是克服远缘杂交不亲和障碍2.动物的细胞培养与体细胞克隆（7）动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、胚胎移植等（8）动物细胞培养经过原代培养和传代培养考点细化： 动物细胞培养液的成分有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等 动物细胞培养基固体，植物细胞培养基液体，培养的动物细胞通常取自胚胎、幼龄动物的组织器官 动物细胞培养时的
11、气体环境是95%的空气+5%二氧化碳的混合气体，CO2 起到调节 PH值作用 使用胰蛋白酶处理使动物组织分散成单个细胞 动物组织处理使细胞分散后的初次培养称为原代培养 贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。这样的培养过程通常被称为传代培养。3.细胞融合与单克隆抗体（9）动物细胞融合与植物原生质体融合的区别：操作步骤不同：植物原生质体融合需要先去除细胞壁，动物细胞无细胞壁；诱导方法不同：动物细胞融合可以用物理、化学和生物三种方法，植物原生质体融合只能用物理、化学方法；最终目的不同：植物原生质体融合最终是为了获得杂种植株，动物细胞融合最主要目的是获得单克隆抗体。
12、（10）单克隆抗体与血清抗体相比特异性强、灵敏度高并可大量制备（11）熟悉单克隆抗体制备过程。考点细化 生产杂交瘤细胞要用B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合 注射相应抗原后，从小鼠脾脏中提取出B 淋巴细胞 杂交瘤细胞既能大量增殖，又能产生专一抗体。 制备单克隆抗体过程中需要两次筛选 体外条件下做大规模培养杂交瘤细胞或者注射到小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或者小鼠腹水内就可以提取出大量的单克隆抗体。联想拓展：杂交瘤细胞融合时，对 B 淋巴细胞为免疫过的B 淋巴细胞一种 B 细胞只能产生一种抗体A 和 B 两种细胞融合，只考虑两两融合，融合方式有 AA、BB、AB 融合三种制备单克隆抗体过程中需要经过两次
13、筛选？第一次：特定的选择性培养基。第二次：抗体检测（13）单克隆抗体在多种人类疾病及动植物病害的诊断和病原鉴定中发挥重要作用。主要用于癌症治疗，也有少量用于其它疾病治疗。拓展：生物导弹中，单抗的作用是导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。既不损伤正常细胞，又减少了用药量。（14）去核卵母细胞能够激发核的全能性，选用的卵母细胞应该是培养到减数第二次分裂中期的卵母细胞（15）核移植技术获得的动物因为有细胞质基因的影响、生活环境的差异、可能发生基因突变造成核移植动物与供核动物性状不完全相同。三、胚胎工程1. 动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础动物胚胎发育的基本过程：受精
14、卵2细胞4细胞8细胞桑葚胚囊胚原肠胚胚胎工程的理论基础：哺乳动物受精和早期胚胎发育规律（1）精子和卵子的产生过程中精子变形，卵子没有。卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前完成的。考点细化：精细胞产生后要经过顶体形成、尾部发育、细胞质浓缩最终精子形成卵子的发生在胎儿时期就完成了卵泡的形成和在卵巢内的储备，排卵前后进行了减数第一次分裂，减分裂在精子和卵细胞结合过程中完成。（2）精、卵细胞结合前各自要发生哪些生理过程？（提示：在受精前精子要在雌性动物生殖道内获能；排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减中期才具备受精能力）。（3）受精过程：精子获能卵子准备阶段受精。卵子防止多精入卵的屏障：透明带反应和
15、卵黄膜封闭作用拓展： 桑椹胚一般指 32 个左右的细胞数目的胚胎。 胚胎分割选用的胚胎最好处于桑椹胚或者囊胚时期，因为全能性较高（6）胚胎工程包含的技术：体外受精技术、胚胎早期培养技术、胚胎干细胞培养、胚胎分割技术、胚胎移植技术（7）获得精子必须经获能处理后才能进行体外受精（8）采集卵子前一般要对雌体进行促性腺激素处理，从较大体型动物卵巢中采集卵母细胞都要经过体外人工培养成熟后，才能与获能精子受精。（9）胚胎的早期培养培养液还需要添加激素和血清（10）获得的早期胚胎有向受体移植、冷冻保存两种去向2. 胚胎干细胞的移植（11）从早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞可以称为胚胎干细胞（12）胚胎干细胞在形态上：体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上，具有发育的全能性。另外在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以增殖二不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可进行遗传改造。（13）干细胞按分化潜能可分为全能干细胞（如胚胎干细胞可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体）、 多能干细胞（具有多向分化的潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，如造血干
