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1、基因工程的工具科学的发展都有一般的规律，显示了解这个世界，进而获得相应的知识，之后再去改造这个世界。生命科学的发展也是如此，当我们解释了生物生命活动的运转规律之后，特别是在分子细胞水平揭示了生命活动的本质规律之后，我们也要运用这些知识对其加以改造，于是就诞生了生物工程。而在生物工程当中，对基因加以操作，进而在分子水平对生物加以改造的就是今天要跟大家探讨的基因工程。首先，给大家介绍一个概念，基因工程是指把一种生物的基因转移到另一种生物的细胞当中，并使这个基因所带的遗产信息在受体细胞中表达，从而使获得基因的个体性状得以改造。那么这个基因工程要达到一个什么样的目的呢？唉，就是要按照我们人类的主观印象
2、去定向的改造生物的性状。可是我们怎么让它获得这种形状呢，也许这种生物本身就没有做这种性状，于是我们就把另外一种具有这种形状的生物的基因转移到这种生物体内，并期望能够实现，这就是基因工程要实现的目的。那么人类为什么会想到这样一个工程呢？而这样一个工程要想实现，它的基本的原理在哪里呢？其实，恰恰就是我们学过的知识。比如说，为什么一种生物的DNA 就能够转移并整合到另一种生物DNA上呢？这是因为生物体遗传物质的基本结构都是基本一样的，即双螺旋结构。（基因工程操作依据的基本原理？1，有细胞结构的生物均以DNA作为遗传物质，且其基本结构相同；2，各种生物表达基因使用一套遗传密码子；3，）进而，为什么他表
3、达的产物一样，从而也产生相似的性状呢？这是因为各种生物表达基因使用一套遗传密码子，当初我们讲密码子的时候特意强调了它的通用性，通用于整个生物界，一张遗传密码子表，无论是兔子还是大肠杆菌，只要转录出的mRNA碱基序列相同，翻译出的蛋白质序列就完全一样，里面的氨基酸都是相同的。所以，正是基于生命在基因表达的机制上是高度一致的，所以人们才想到基因工程，并将其实现。这就是基因工程得以实现的理论基础，是完全可行的。为了了解基因工程的工具以及基因工程的操作原理，我们不能空谈，应该说基因工程给我们带来很多梦想理想，那么实际我们做成了哪些项目呢？我们来看这样一项，有一种害虫，专吃棉花的叶子，把它吃的左一个坑右
4、一个洞的，大大降低了叶片进行光合作用的效率，进而导致棉花减产，但是怎么控制呢，一般人可能会想到使用农药，但不但农药污染环境而且对人体也有危害，于是就有科学家使用转基因手段获得了一种转基因抗虫棉，追究起来，这是转的谁的物质呢？人们后来从一种细菌（苏芽孢杆菌）体内发现了一种物质，这种物质是细菌的伴孢晶体，它实际上是一种蛋白质，它能够有效的杀害棉铃虫，因为这种物质被虫子吃了之后能够破坏其消化道细胞的正常功能，于是虫子就被杀害。这种转基因的抗虫棉叶片成功的转入这种杀虫蛋白之后，当被棉铃虫摄取进入体内，就破坏其消化道细胞，于是虫子就被毒死了。这样就大大的降低了这种害虫的种群密度，进而保证了棉花的高产。那
5、么这样的抗虫棉如何做呢？下面简单介绍一下具体的过程：首先，我们要从苏云芽孢杆菌体内提取指导合成伴孢晶体这种杀虫蛋白的那一段基因，我们管它叫抗虫基因，然后把它与运载体DNA拼接（这里需要解释一下了，因为我们很难把这段基因直接导入棉花细胞当中，它未必能够接受，那么怎么办呢？通常是把它与另外一个DNA连接，这段DNA就起运载这段基因片段的作用，负责把它运载进入细胞，使细胞乐于接受）；与运载体拼接之后，将这种混合的DNA导入到受体棉花的细胞当中，进而就获得了转基因抗虫棉。（苏云芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花植株）。简单了解了这样一个过程之后，我们来思考两个问题：1，如何从苏云金芽孢杆菌
6、中辨别出所需基因并把它切割下来？用什么剪切呢？2，如何将切割下来的抗虫基因与运载体DNA“缝合”起来？用什么缝合呢？接下来，我们介绍一下基因工程操作所需要的工具。首先，用到的剪切工具，即基因的剪刀，叫做限制性内切酶（一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子）。切割之后用什么连接呢？这就是DNA连接酶，操作的过程中使用的基因的运输工具是运载体。下面我们逐一为大家展示一下基因工程的工具，首先是限制性内切酶，这些酶是从哪里得到的呢？其实是存在于一些微生物当中的酶，特别是细菌中原本就有这些限制性内切酶，细菌细胞中为什么要有这些东西呢？其实细菌细胞中有时候会进来一些外来
7、的DNA，对于细菌本身而言，这显然是一种有害的东西，所以限制性内切酶起到了一种防护的作用，当然也不排除会剪切细菌本身细胞内一些活性大大减弱的无用的核酸分子。所以这些限制性内切酶是自然界本身就存在的，并不是人类自己创造的，只不过是将其取过来使用而已。限制性内切酶在作用时候有一个特点，就是具有特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。具体地说就是，它在发挥作用的时候有一个特定的位点，绝不是乱切，它要在漫长的DNA序列当中去寻找符合自己的那几个碱基，并且得保证他们是正确的顺序，找到这样的序列之后，然后在两个碱基之间进行切割，从而使得发挥作用时候具有一个高度的特异性。这就是限制性内切酶切割DNA时候
8、的一大特点。接下来，大家想一下，当切割之后会怎么样呢？由于切割是在特定位点切开，切开之后往往出现的切口是不平的，两条链一般是突出的，突出的部分往往是互补的，所以就很容易重新形成氢键，进而又恢复连接的状态，所以我们经常将经过限制性内切酶切割之后形成的切口称作粘性末端（被限制性内切酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做粘性末端，如Eco R I，即）。下面我们来看一个例子，这个例子是来自于大肠杆菌的一种限制性内切酶，EcoRI，它能够识别GATTC序列，并且在GA之间切开，这就是它切割的特异性，只是别这样的序列，并且只在这两个碱基之间切开。这种酶切
9、割的序列比较有特点，一条链从左往右读为GATTC，另外一条链从右往左读也是GATTC，几乎所有限制性内切酶所识别的序列都是如此，所以我们形象的将它称为回纹序列。然后请大家判断一下，这个限制酶切割DNA的时候，究竟断裂的是什么化学键呢？是氢键吗？实际上氢键并不是这个酶断裂的，氢键自己可以断裂也可以自发的形成，它所破坏的是共价键，具体来说是GA碱基之间的35磷酸二酯键，切割之后，有一条链向前突出，突出的这两条链又恰好互补，所以富有粘性，因此叫做粘性末端。所以在合适的条件下，这些碱基之间特别容易自发的形成氢键。但是这并不能解决问题，因为共价键依然断裂，如何重新将共价键重新建立，这才能够将两条链重新完
10、整的连接结合回去。这是我们刚才介绍过的Eco R I，除此之外，还从细菌当中提取出了很多的限制性内切酶，比如Hind III、Taq I 等等。他们都是特异性的作用于DNA，识别特定的碱基序列，并在特定的碱基之间切开，这就是限制性的含义。-G ATTC- -GTC GAC- -CTTA G- -CAG CTG-当然这里强调一点，就是并不是所有限制性内切酶切割之后的末端都是粘性的，某些酶切割之后也可能是平齐的，形成的末端又叫做平末端（如Hind III，即）。思考：我们要想获得某个特定性状的基因，我们必须要用限制酶切开几个切口呢？我们要向把一个片段切下来，必须要在两端个切开一个切口，所以得切两个
11、切口。如果把两种不同来源的DNA用同一种限制酶来切割，会怎么样呢？虽然DNA来源不同， 但是如果用同一种来源的限制酶，同一种来源它是相同的，切割位点也是一样的，因此必然会产生相同的粘性末端，而拥有相同粘性末端的片段，有一种相互粘合在一起的这种潜力，可真正的要想让他连接成完整的DNA分子，那还需要另外一种酶，即DNA连接酶。两个拥有相同粘性末端的DNA片段很容易自发的建立氢键，但是要想真正粘合回来，必须要将3，5磷酸二酯键缝合起来，才是真正的完整的形成了重组DNA。这就得靠DNA连接酶，DNA连接酶催化连接的不是氢键，而是核苷酸之间的磷酸二酯键（形象的说，它连接的不是梯子的踏板，而是梯子的扶手）
12、。那么我们具体看一下这个过程，拥有相同粘性末端的两个DNA片段，那怕它们是不一样的，也完全可以被DNA连接酶催化连接，形成氢键后，由DNA连接酶抹平这个断裂口，于是两个DNA片段就成功的连接在了一起。如果通过这种方式将目的基因与与载体联合，便可以形成重组DNA分子，而重组DNA证实基因工程核心的技术。接下来，我们来介绍一下基因工程当中的运载体。一个外源性的DNA要想进入受体细胞内，一般是不容易被接受的，为了让它便于被接受，就必须将它于另外一个东西结合在一起，由它带着给送进去，这样就容易被接受，这样一种工具就叫做运载体，运载体的作用，一方面在于作为运载工具，将外援基因转移到受体细胞当中去，另外一
13、方面也靠运载体，外源基因不容易丢失，甚至可以在受体细胞内进行大量复制，并得以保持。这就提出了运载体必须具备的几个条件：1，能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。也就是呆得住不会丢，但是宿主细胞本身会分裂，一旦分裂就会造成这种运载体以及目的基因的丢失，为了防止这种情况的出现，运载体必须在宿主细胞内进行复制使本身达到一定的数量，这样，即便宿主细胞分裂，也能够落下一些，子细胞也能够获得运载体，这样运载体就可以一直存在。2，具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接。通过学习“剪刀”以及“针线”，大家已经知道如何组建重组DNA，它需要同一种限制性内切酶去切割目的基因以及运载体。那么为什么要要求运载体上有多个切
14、点呢，有一个不行吗？有多个酶切点，也许就会有得选择，因为，某些在切割目的基因的时候，也许只有某种酶才合适，那么就得保证运载体也可以用这个限制酶切点，因此有更多的限制酶切点就可以有更多的选择。3，具有某些标记基因，便于进行筛选。这里需要强调一下，标记基因是干什么的呢？是说当运载体导入受体细胞之后，运载体所携带的标记基因所能表达出的性状就能够得以体现，从而是我们知道受体细胞依然获得运载体，当然也就有可能获得目的基因，这样就便于将来筛选获得目的基因的受体细胞。所以要有一个额外的标记基因，最常见的标记基因就是抗生素的抗性基因对于某种抗生素的抵抗力，也就是说一旦受体细胞获得了这种运载体的话，它同时也就获
15、得了对某种抗生素的抗性，假设受体细胞是细菌的话，那么这种细菌就能够在加有这种抗生素的培养基中长出菌落，那么我们就知道这种细菌准是获得了运载体，它也就有可能获得了目的基因，实现了对其的筛选；当然，除了这种抗生素抗性基因，还有产物具有颜色反应的基因等能够让我们看出它是否获得了某种相应的运载体。4，能够启动外源目的基因的转录和翻译。也就是说这个运载体带上目的基因之后也能够保证这个基因在他的身上顺利的表达。基因工程当中最常用的运载体就是质粒。类似与运载体，质粒也不是人造的，它是细菌细胞当中独立于拟核之外的小型环状DNA，也就是质粒是细菌细胞当中原本就有的核外DNA，因此，它绝对能够很友好的借居在宿主细
16、胞内，不会受到排斥。而且一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用，不能说没有质粒就不能活，达不到这种程度，不会影响生存。而关键是，质粒作为细菌细胞拟核之外的一个小型环装DNA分子，它居然能够独立的复制，进而就帮助其上面目的基因实现了复制，这样一来就完全满足作为基因工程运载体的条件，即呆得住且不会丢，在细胞当中能够友好的借居。而一旦细胞发生分裂，由于在之前，质粒经过了大量的复制，所以能够分配到子细胞中，子细胞中依旧保持这样一个质粒和目的基因，因此它是非常好的基因工程运载体。接下来就是常见的一种质粒，在这样的小型环状DNA分子上，有多种限制性酶的酶切位点。限制酶的位点越多，我们的选择也越多，可以从不同的位点切开。我们可以看到这样一个质粒中含有一个氨苄青霉素抗性基因和一个四环素抗性基因，这是两种
