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1、 综 述 单细胞凝胶电泳检测单细胞DNA损伤 山西医科大学 030001 杨建一 彭 芸 李 莉 遗传毒理学家主要关注的三大遗传学损伤 即基因突 变 染色体畸变及染色体数目改变 这些损伤多因DNA受 损所致 其本质是相同的 区别在于其损伤的程度 1 由此 DNA损伤与修复就成为生物医学领域特别是遗传毒理学 及肿瘤学等领域的核心内容之一 传统的毒理学检测终点 是组织病理学改变 过程繁琐且不理想 迄今为止检测 DNA损伤与修复最敏感的终点是测量DNA单链断裂 2 本 文 所 论 述 的 单 细 胞 凝 胶 电 泳 single cell gel electrophoresis assay SCGE
2、 又称彗星实验 comet assay 或微凝胶电泳 m icrogel electrophoresis M GE 正是一种 在单细胞水平上检测有核细胞DNA断裂的一项新技术 自O stling等 3 成功应用以来经不断改进 已成为一种快 速 灵敏 简便的检测DNA损伤的方法 1 SCGE的发展 O stling和Johanson首先发明了微凝胶电泳技术 将 细胞包埋于显微玻片上的低熔点琼脂糖凝胶中 用高浓度 去污剂和盐裂解 然后在中性条件下短时间电泳 DNA断 片就会从细胞核向阳极迁移 从而形成 彗星 样拖尾 尾指 向阳极 这种方法检测的是双链DNA断裂 double2 stranded b
3、reaks DSBs 不 能 测 定 单 链 断 裂 single2 stranded breaks SSBs 而许多物质诱导的DNA单链断裂 较双链断裂高5 2 000倍 所以这种方法有一定的局限 性 1988年Singh等 4 提出碱性单细胞凝胶电泳方法 在 碱性条件下可使DNA变性并作用于碱性脆性位点 同时 使RNA降解防止干扰 经溴化乙锭 EB 染色后显示明显 的断裂 灵敏度大大提高 2 SCGE的原理 SCGE的原理还不是很清楚 但目前一般观点认为在 细胞核中DNA是呈环状附着在核基质上的 细胞分裂时 核基质被溶解 抽提 但DNA仍保留核样结构 当断裂剂 作用于细胞时 DNA出现单链
4、或双链断裂即在DNA链上 出现缺口 使DNA超螺旋变得松弛 5 高pH 13 使 DNA变性 解螺旋 同时由于缺口暴露了阴电荷 在电场力 作用下DNA断片向阳极迁移 6 但DNA一端仍附着于核 DNA 其迁移距离受到限制 DNA 的移行可用EB染色后 在荧光显微镜下观察 如果DNA损伤大 断片移行的距离 长 即 尾部 长并且荧光强度增高 未受损的细胞则只有圆 形的荧光头部 而无彗星样尾部 7 实验结果再进行人工计 数 测量或输入软件分析 得出统计结论 判断DNA受损 情况 3 SCGE实验方法 311 细胞来源及处理 从理论上讲 SCGE可用来检测任 何真核细胞的DNA损伤 Kleinsass
5、er等 8 用SCGE分析 了人外周血淋巴细胞与上消化道黏膜细胞对遗传毒性物质 的敏感性比较 Eastham等 9 用成纤维细胞进行了该项实 验 药物对睾丸细胞和精子的DNA损伤作用也曾用SCGE 进行综合分析 10 此外表皮细胞 肿瘤细胞及实验动物的 实质脏器细胞都可作为靶细胞 细胞来自培养的细胞或从 活体组织分离的细胞 Singh等 11 提出在玻片上或直接制 成细胞悬液 加入受试物孵育一段时间后去除受试物 检测 DNA损伤 12 另外 观察处理后培养不同时间的 彗星 以 研究DNA的修复情况 13 体内实验时可以给动物以不同 途径染毒 间隔一段时间或取不同时间段分离组织细胞进 行SCGE
6、分析 312 制胶 以无钙 镁磷酸缓冲盐溶液 PBS 配制015 正 常熔点凝胶和低熔点凝胶 加热熔化后 备用制胶 第一层 胶的制备 在毛玻片上滴加110 L 015 正常溶点凝胶 加 盖盖玻片 此层的目的是促进含细胞的胶层与玻片附着 4 固化10m in 第二层胶的制备 以PBS将受试细胞配成 1 108 1 1010个 L细胞悬液 取50 L 约1 104个细 胞 按1 3的比例与015 低熔点凝胶混合 待第一层胶 凝固 平整 有光泽 后揭去盖片 滴加75 L 015 低熔点 凝胶与细胞悬液混合液 加盖盖玻片 4 固化10 m in 第 三层胶的制备 揭去盖玻片再滴加110 L不含细胞的
7、015 低熔点凝胶 同样加盖 4 固化10m in 313 裂解 去掉盖玻片 将凝胶片浸入冰冷的裂解液中 含 215 mol L N aCl 100 mmol L N a2EDTA 10 mmol L T ris 1 肌氨酸钠 10 DM SO 1 T ritonX2100 4 裂 解1 h 使细胞裂解 DNA松散 314 电泳 裂解后取出玻片 用PBS缓冲液漂洗3次后置 于水平电泳槽内 加入pH 13的电泳缓冲液 含1 mmol L N a2EDTA 300 mmol L N aOH 至没过玻片2 3 mm 使 DNA解螺旋20m in 之后 接通电源 在电压23 25V 电 流280 30
8、0mA的条件下电泳30m in 电泳完毕后用PBS 漂洗3次 每次3m in 315 染色 溴乙锭 EB 染色 胶上滴加30 L 20 mg L EB 加盖盖玻片 24 h内检测 或在4 潮湿 避光的条件 下保存胶片 观察时再行染色 镜检 上述过程均应在黄光或暗室中操作 避免引起额外的 DNA损伤 316 实验结果分析 染色后 在荧光显微镜下放大200倍 或400倍进行图像分析 拍照或利用相应的图像分析软件 进行分析 004 山西医药杂志2002年10月第31卷第5期 ShanxiM ed J October 2002 Vol 31 No 5 常用的评价实验结果的指标有 头长 全长 彗星 尾长
9、 即全长减去头长 密度 拖尾率 计数 定量的细 胞 其中拖尾细胞所占的比例 拖尾率是比较粗略的指标 在镜下观察直接得到 较方便 尾长评价DNA损伤程度易 于测量 且在损伤因素剂量较小时与作用剂量间有较好的 线性关系 有实验证实损伤因素作用剂量较大时DNA损 伤程度明显增加而尾长基本不变 此时尾部DNA密度 荧 光强度 与损伤的关系则更为密切 为全面反映DNA损伤 程度 O live等 14 提出用尾部DNA百分含量与尾部距离相 乘得到尾素 tail moment 进行评价 损伤因素剂量大时尾 素与损伤程度有良好的线性关系 Kent等 15 利用图像分 析软件总结出彗星时刻公式 彗星时刻 6 0
10、 n 离开X远处DNA含量 距离X DNA总量 其中X为距离头部中心距离 此公式在大剂量时更好 地评价损伤程度 图像分析软件能提供全范围密度及参数 描述彗星整体及各部分的特征 但由于价格昂贵 不能广泛 使用 4 SCGE的优点 本方法较其他遗传毒性检测方法相比具有灵敏性高 样品需量少 便宜 便于应用及耗时短等优点 16 所需靶细 胞数目少 1 000个 适用范围广 凡能制成单细胞悬液 的真核细胞都可进行DNA损伤研究 并且对各种细胞都 敏感 SCGE可检测出低于011个DNA断裂 109 无需放 射性核素标记 操作简单 从取材 染毒到观察结果仅需数 小时 既可体外染毒又可进行体内实验 克服了体
11、外实验不 能反映体内作用情况的缺点 实验所需的仪器 设备一般实 验室都可具备 适用于大样本量调查 分析 SCGE可检测 DNA断裂 碱性脆性位点 AL S DNA 2DNA 蛋白质交联 及与不完全切除修复位点相关的DNA单链断裂等 在分 子水平反映毒理学效应终点 已广泛应用于遗传毒理学 放 射医学 生物监测 肿瘤学等领域的研究 5 SCGE的应用及前景 SCGE已被广泛用于体内 体外实验 评估各种试剂对 哺乳动物造成的损伤及修复作用 电离辐射 过氧化物是最 常见的DNA损伤因素 它们直接作用于DNA链使其产生 断裂 应用SCGE检测这些损伤具有很大的优势 与上述致 突变物不同 紫外线不会直接造
12、成DNA链的断裂 它是典 型的通过切除修复途径造成DNA损伤的一类物质 SCGE 可对其进行快速 敏感的定量检测 海拉细胞有大量的三磷 酸脱氧核糖核苷 dN TPs 紫外线照射后不会产生DNA 切口 但当与DNA合成抑制剂共同孵育时通过SCGE即 可看到明显的荧光拖尾 并可通过彗星尾长的程度估计紫 外线的剂量 渗透性细胞的核对外来蛋白 抑制物 脱氧核 苷酸等具有通透性 利用这一特点对通过通透性细胞行 SCGE可探讨DNA修复的分子机制 17 511 在遗传毒理学中的应用 致突变效应 致癌效应是遗 传毒性的长期效应 突变的程度和类型又与DNA链损伤 修复的情况相关 SCGE能检测出各种理化因素所
13、致的 DNA链断裂 DNA加合物的形成 DNA切除修复 氧化损 伤及DNA交联 并以其快速 灵敏 简便的优点成为遗传 毒理学研究的主要工具 进行体内实验的SCGE分析可减 少假阴性结果 并提供各组织 器官 细胞中DNA损伤和 修复的信息 推测组织或细胞特异性 SCGE可检测低水平 辐射 0 105 Gy 所造成的DNA损伤 研究不同辐射损伤和 修复差异 SCGE克服了全面普查与监测工作的缺点 成为 化学性毒物检测的重要方法之一 目前已用此法进行了镉 镍 砷 汞等多种化合物的DNA损伤作用及木尘 石棉 煤 烟的致癌作用 18220 512 在预防医学中的应用 在生产过程中经常接触到损伤 细胞DN
14、A的物质 SCGE有望成为检测低浓度职业损害因 素的早期客观指标 在环境监测中用SCGE测定DNA损 伤水平 成为分子流行病学的一项重要手段 21 使用人外 周血淋巴细胞监测暴露于遗传性有害因素的生物监测 Hellman等 22 用SCGE分析测定饮用水和室内空气氡的 DNA损伤情况 N arendra等 23 报道应用SCGE技术测定 不同浓度乙醛对人外周血淋巴细胞的DNA损伤及修复作 用 513 在肿瘤学的应用 在癌细胞中有一种缺氧细胞 它的 DNA断裂比有氧细胞低 用SCGE分析可估量缺氧细胞 数 进一步识别与检查癌细胞对抗癌剂的反应 主要用于接 受化疗的肿瘤细胞 24 有助于评估肿瘤对
15、放 化疗反应的 不同 预测治疗方案的效果 DNA双链断裂是凋亡细胞的 特征 因此SCGE可检测凋亡细胞 许多肿瘤治疗方案又是 通过细胞凋亡达到杀死肿瘤细胞的目的 所以利用这一原 理也可评价肿瘤的放 化疗效果 514 在药物检测中的应用 现行新药临床前遗传毒性的检 测亟需引入新方法与新技术 以适应新药开发和生产对安 全性的更高要求 SCGE与生化方法 细胞遗传学方法相比 能提供单个细胞中DNA损伤的情况 用于检测未引起骨 髓微核的化合物在靶器官中的遗传毒性 弥补了微核试验 对特异性器官的局限性 拓宽了应用范围 25 现已用SCGE 分析法检测了博莱霉素 氮芥等多种抗癌 抗免疫药物 7 将几种方法
16、结合使用对于认识潜在致突变物的结构 机制 具有重大意义 6 结 语 SCGE能敏感检测单细胞水平的DNA链断裂 具有快 速 简便 价廉等优点 广泛应用于遗传毒理学 预防医学 环境生物监测 药物筛选等多个研究领域 但在实验中还有 一些问题尚待改进与解决如 彗星 形成原理 电泳条件的 探索 玻片制备中的掉胶现象 数据整理后的判断标准等 随着实验方法的不断改进 与其他技术如免疫学等的结合 SCGE在各领域的应用将进一步拓宽 参 考 文 献 1张桥 1 卫生毒理学基础 1 北京 人民卫生出版社 200111151 104 山西医药杂志2002年10月第31卷第5期 ShanxiM ed J October 2002 Vol 31 No 5 2O live PL Ranath JP Durand R Heterogeneity in radiation2 induced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the comet assay Radiation Res 1990 122 86 3O stling O Johabs
