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1、细胞色素C 小组成员 潘炯琛 吕武燕 汪晨蕴 臧月梅 蔡晨 郦元 细胞色素C 包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称 它广泛存在于各种动物 植物组织和微生物中 细胞色素C是呼吸链中极重要的电子传递体 它主要存在于线粒体中 需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中 细胞色素C含量丰富 理化性质 细胞色素C 分子质量约为13000 蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成 其中赖氨酸含量较高 为碱性蛋白 等电点10 2 10 8 含铁量0 37 0 43 易溶于水 在酸性溶液中溶解度更大 故可用酸性水溶液提取 理化性质 细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应 故可分
2、为氧化性和还原性 前者水溶液呈深红色 后者水溶液呈桃红色 细胞色素C对热 酸和碱都比较稳定 但三氯乙酸和乙酸可使之变性 引起部分失活 细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物 在测定含量时 要加入联二亚硫酸钠 使混合物中的氧化型转变为还原型 还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大吸收值 临床应用 细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂 在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状 使其物质代谢 细胞呼吸恢复正常 病情得到缓解或痊愈 如 一氧化碳中毒 催眠药中毒 新生儿窒息 严重休克缺氧 麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难 高山缺氧 脑缺氧 心脏疾病引起的缺氧等 基本原理 细胞色素C是易
3、溶于酸性溶液 故采用酸化水提取 人造沸石为铝酸钠 它是一种阳离子交换剂 细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙 在pH7 5时细胞色素C呈正电荷 它可与沸石分子上的钠离子发生交换 从而被沸石吸附 装入层析柱后 用25 硫酸铵洗脱 可将细胞色素C交换下来 硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C的亲和力 硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度 主要为去除杂蛋白 另外三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合 必须严格控制三氯乙酸用量 单击此处添加标题 匀浆 提取液 新鲜猪心 氨水 PH6 过滤 滤液 氨水PH7 2过滤 人造沸石 水 NaCl 硫酸铵 洗脱液 硫酸铵盐析 滤液 TCA沉淀 离心 沉淀物 蒸馏水 细胞色素
4、C粗品溶液 硫酸 PH4 细胞色素C的制备和测定 材料与试剂 新鲜 冷冻 猪心样品 200g 1mol LH2SO4 500mL1mol LNH4OH 500mL12 BaCl2 250mL25 NH4 2SO4 500mL0 2 NaCl 500mL20 三氯乙酸 TCA 100mL人造沸石 白色颗粒 40 60目联二亚硫酸钠细胞色素C标准液 3mg ml 仪器 绞肉机 电磁搅拌器 离心机 分光光度计 烧杯 1000ml 500ml 200ml 50ml各若干 量筒 移液管 玻璃漏斗 玻璃棒 纱布 滤纸 容量瓶 试管 离心管 步骤 步骤 1 猪心预处理与提取2 中和3 吸附与洗脱4 盐析5
5、TCA沉淀6 标准曲线的制备 1 猪心预处理与提取 1 新鲜或冷冻猪心 除尽脂肪 血管和韧带 洗尽积血 切成小快 放入绞肉机中绞碎 两遍 2 称取猪心碎肉200克 加蒸馏水300毫升3 用电磁搅拌器搅拌提取 再用1mol L的硫酸调PH 4 0 需要不断调整 搅拌提取1 5小时 用1mol L的氨水调PH 6 0 停止搅拌 4 四层纱布挤压过滤 收集滤液 2 中和 用1mol L的氨水调滤液PH 7 2 7 5 静置20 30分钟 使沉淀沉下 过滤除杂质 下部浑浊液离心 3000rpm 15min 合并得到的红色清夜 测量体积 3 吸附与洗脱 吸附 加10 人造沸石 磁力搅拌器搅拌吸附1h 蒸
6、馏水洗3次 0 2 NaCI溶液洗3次 蒸馏水洗3次 滤出人造沸石待用洗脱 在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水 将沸石放入柱中 装满25 硫酸铵溶液进行洗脱 流速控制在2ml min以下 收集红色的洗脱液 4 盐析 为了进一步提纯细胞色素C 向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵 即100ml洗脱液加17g硫酸铵 边加边搅拌 放置30分钟 杂蛋白沉淀析出 过滤 收集红色透亮的细胞色素C滤液 测量体积 5 TCA沉淀 按8 体积滴加TCA 边加边搅拌 此时细胞色素带正电荷 与其结合生成可逆沉淀析出 立即离心 3000rpm 15min 收集沉淀 若上清液仍为红色 倒出后再补加5 体积的TCA 再次离心 收集沉淀 沉淀用少量去离子水溶解 体积不超过10mL 6 标准曲线的制备 以细胞色素C的浓度 mg ml 为横坐标 以吸光度A520nm为纵坐标制作标准曲线 按表绘制细胞色素C含量的标准曲线 纯度检测 因为细胞色素C属蛋白质 所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度 从而评价所的样品的质量 具体操作 预先配置聚丙烯酰胺凝胶 样品和标准品分别混合缓冲液点样 再点上标准屏 在恒定电压作用下 达到分离的目的 后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色 后同脱色液脱去多余染液 得到电泳图 Thankyou 感谢亲观看此幻灯片 此课件部分内容来源于网络 如有侵权请及时联系我们删除 谢谢配合
