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1、微孔板检测抗生素在牛奶中的残留摘 要：抗生素作为动物药物和饲料添加剂被广泛应用，势必会造成抗生素在动物性食品内的残留，特别是牛奶中抗生素的残留已引起消费者的重视。为了保障人们饮用牛奶的卫生和安全，对牛奶中抗生素残留检测技术的研究不断发展，本研究旨在探究一种简便、快速、准确和敏感性高的检测方法以满足日趋严格的残留限量的要求。 关键词：高通量；微生物；抗生素；牛奶抗生素在乳畜饲养业中起着预防和治疗疾病等重要作用。这些抗生素能通过动物体的转移、富集进入人类食物链，最终导致人类在食用过程中抗生素的累积。因此，探索简便、快速、准确，且敏感性高的检测方法满足日趋严格的残留限量要求，来保障人们饮用牛奶的卫生
2、和安全有现实意义。牛乳中抗生素残留的检测方法主要有微生物检测法、理化检测法、免疫学分析法。免疫分析法或试剂盒检测法灵敏度高，但是检测成本要求较高，不易于推广。目前应用比较普遍的方法是先用微生物法进行筛选，再用色谱法进行定性定量检测。本研究采用高通量微生物法检测牛奶中的抗生素残留，仪器要求简单、成本低廉、一次试验能够同时检测多种抗生素，适合奶场和基层实验室使用。一、材料与方法1.材料（1）样品与菌种试验用的牛乳为市售袋装牛乳；供试菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（中科院微生物研究所）。（2）试剂青霉素、四环素标准品购自Sigma公司，其它试剂均为分析纯。标准贮备液：精密称
3、取青霉素、四环素标准品各0.0100 g，分别用超纯水溶解并定容至100 mL，浓度均为100g/mL。（3）培养基固体培养基：蛋白胨5 g；牛肉膏3 g；氯化钠5 g；琼脂15 g，溶于蒸馏水中，用NaOH溶液调pH为7.0，最后定容至1000 mL，分装于锥形瓶中，121高压灭菌20 min。液体培养基：蛋白胨5 g；牛肉膏3 g；氯化钠5 g；蒸馏水1000 mL，用NaOH溶液调pH为7.0，分装于锥形瓶中，121高压灭菌20 min。检测培养基：牛肉膏2.5 g；葡萄糖10 g；酵母粉2 g；溴甲酚紫指示剂0.03 g；蒸馏水定容至1000 mL，pH调至7.5，分装于锥形瓶中，12
4、1高压灭菌20 min。2.方法（1）菌液的制备严格无菌状态下，在固体培养基上挑取已培养24h的细菌单菌落，接入液体培养基中，30下震荡培养78 h，得枯草芽孢杆菌菌悬液。（2）微孔板检测取检测96孔板，在第1列只加入200L检测培养基，在212之间加入200L检测培养基和菌悬液的混合溶液（其中检测培养基85%，菌悬液15%），然后在第1、2列上加入50L无菌水，在312列加入50L不同的样品溶液，在30恒温培养箱中培养5 h，然后观察颜色变化。（3）检测限的确定用不含抗生素的牛乳稀释溶液将两种抗生素的标准贮备液稀释成0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.30、0.40、0.5
5、0、0.60、0.80g/mL等10个标准溶液，按上述方法进行检测，确定检测菌种对抗生素的检测限。二、结果与讨论枯草芽孢杆菌是微生物检测抗生素残留方法的常用检测菌，按本研究所建立的方法，枯草芽孢杆菌对两种抗生素添加检测溶液的变色浓度见表1。采用该菌种对抗生素的检测限略高于残留限量，因此，不能单纯采用枯草芽孢杆菌作为检测菌种进行筛检，否则会漏检一些超标样品，应与其它检测方法配合使用，如经微生物筛选之后，进行高效液相色谱法确认分析。表1枯草芽孢杆菌的变色浓度（g/mL）抗生素 药物浓度 显色 结果判定青霉素 0.10 黄色 阴性0.20 紫红色 阳性四环素 0.08 黄色 阴性0.10 紫红色 阳
6、性三、结论采用微板进行抗生素残留的微生物筛选检测，可以在一个板上进行多个样品检测，几十个样品的筛选实验可以在四五个小时内完成，比传统的平板法省时省力，采用指示剂显色作为判别标准也比抑菌圈更易于观察，因此有较好检出限。本研究中所建立的方法，较之其他微生物方法，该方法操作简单易于掌握，微孔检测的成本极低，具有明显的价格优势，适于推广应用。参考文献：1 刘军安，高美虹，黄运丽.牛奶中抗生素残留检测方法的研究进展及展望.湖北农业科学，2010，49（6）：14811483.2 吴瑕，邵辉，王鑫，张兰威. 试管扩散法检测牛乳中-酰胺类抗生素残留研究.东北农业大学学报，2011，42（5）：3135.3
7、李亮，林曦，薛早早. 食品中农药残留的高通量微生物检测方法研究. 中国微生态学杂志，2012，24（4）：361363.4 李晓红，王菲菲，迟涛. 乳中抗生素残留及其检测方法.中国乳品工业，2010，38（11）：3640.5 景许连，孙玉马. 牛奶中抗生素残留及其检测分析研究进展.产业市场，2011，12：3335.6俞漪，胡雪莲，巢强国.液体乳中抗生素残留量快速检测方法探究.食品研究与开发，2010，31（8）：1323136.作者简介：邹鹏（1980-4），女，学历：研究生，单位：黑龙江民族职业学院，职称：讲师，研究方向：微生物。基金项目：黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室（黑龙江大学）（英文名：Key Laboratory of Microbiology， Heilongjiang Province， Harbin， China）”开放课题资助
