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1、第四章 抗体工程制药,教学目标：掌握抗体药物制备的基本原理和技术。教学要求：了解免疫现象和抗体药物制备的发展简史，了 解基因工程抗体和抗体工程技术的基本内容；理解抗 体药物的结构和生物学活性与单克隆抗体靶向制剂的 研究意义；掌握单克隆抗体的基本概念与制备原理和 鼠源性单克隆抗体的改造方法。教学重点：单克隆抗体的基本概念与制备原理和鼠源性单 克隆抗体的改造方法。教学难点：抗原表位的概念、单克隆抗体的制备原理。,Contents of chapter 4,1、概述,2、单克隆抗体的制备,3、鼠源性单克隆抗体的改造,4、基因工程抗体和抗体工程,Go,Go,Go,Go,Go,5、抗体药物,“疫”：流行
2、性传染病，免疫即免于发生传染病。尽管近代才出现“免疫”这个词，但是人们在远古时代就已认识了免疫现象。公元前5世纪希腊半岛的战史中，描述了在传染病流行时，由患过该病的人来护理病人和埋葬尸体的事例。公元384年，晋朝葛洪在肘后备急方中记载“疗狂犬咬人方，乃杀所咬犬，取脑傅之，后不复发” 。,4.1 抗体工程制药概述,1、有关免疫学知识,免疫是机体对异种、异体及自身物质所产生的反应，即机体“自我识别，排除异己”，以达到自身稳定的一种复杂的生理性保护，并且与人体的胚胎发育、疾病发生、衰老等一系列的生命过程有密切关系，是人体进化的结果。 免疫学是研究人类和实验动物体内、外免疫反应的本质及其变化规律的科学
3、。 免疫系统是由淋巴器官（胸腺、骨髓、淋巴结、脾和扁桃体）、淋巴组织以及免疫细胞（淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞）借助血液和淋巴循环相互联系而组成的功能系统。,T淋巴细胞（表面有抗原识别受体）,巨噬细胞,B淋巴细胞（表面有抗原识别受体）,人体内三种主要的免疫细胞,巨噬细胞,B细胞,T细胞,抗原识别受体,目标对象,作用方式,无,有（表面有1000个抗原识别受体，有特异性）,有（表面有10万个抗原识别受体，有特异性）,几乎所有的抗原类物质如细菌、病毒、衰老细胞。,体液中的抗原（部分病毒除外），如细菌。,吞噬或感染了病毒等抗原的细胞、外来器官等。,吞噬,产生抗体,释放细胞毒素,三种免疫细胞的比较,外源蛋
4、白、细菌、病毒等抗原,B细胞作用过程(体液免疫),浆细胞,B细胞,产生抗体,抗体使抗原失去活性,特异抗原识别受体,T细胞作用过程（细胞免疫）,感染了抗原的细胞或吞噬了抗原的巨噬细胞，外来细胞。,T细胞,活性T细胞,产生细胞毒素攻击受感染细胞。,受感染细胞死亡,自然被动免疫 母体的特异性抗体IgG通过胎盘或初乳中的分泌型IgA进入胎儿体内或婴儿体内，使胎儿或婴儿被动的获得母体抗体的方式。 婴儿在出生后6个月内很少得传染病，是从母体获得被动免疫的结果。,自然自动免疫 在自然条件下，人体被病原体感染后所获得的免疫力。这种免疫可以通过得传染病获得，也可经过隐性感染获得。,宋朝（十一世纪）时吸入天花痂粉
5、预防天花 ；明代（公元十七世纪七十年代左右）接种“人痘”，预防天花； 十八世纪后叶，英国乡村医生Jenner种“牛痘”预防天花。,病原菌致病与疫苗,十九世纪中叶，显微镜的改进导致病原菌的发现；1850年在羊的血液中看到炭疽杆菌；Pasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染致病； Koch提出病原菌致病的概念； 正式认识Jenner的接种牛痘苗、预防天花的科学性和重大意义。,人工自动免疫 用人工接种的方法向机体输入抗原性物质，使机体自己产生特异性免疫力。 免疫力出现较慢，人工接种后需经14周诱导期方可产生；但维持时间达半年到数年不等，主要用于传染病的特异性预防。,白喉造成人类疾病有2500
6、年的历史，十八世纪初，在新英格兰的白喉大流行，使得2.5的人口死亡，有三分之一的儿童死亡。在类毒素治疗发明之前，白喉是15岁以下儿童的三大死因之一。 1884年，首次分离出白喉杆菌，白喉杆菌是一种革兰氏阳性杆菌，在有氧及37的环境下，生长良好。 人的鼻咽部若受到白喉杆菌感染，会产生毒性很强的外毒素，抑制正常细胞蛋白质合成，引起局部组织破坏及形成白色膜状物，毒素可经由血液到达全身，主要造成心肌炎、神经炎，血小板低下及蛋白尿。,十九世纪八十年代后期，发现白喉杆菌经其分泌的白喉外毒素致病；随后发现再感染者的血清中有“杀菌素”-抗体；1890年， Behring和Kitasato用白喉抗毒素治疗白喉病
7、人。,Behring（德）和 北里柴三郎(日)用白喉脱毒外毒素注射马等动物，在动物血清中发现了一种能中和白喉外毒素的物质，称为抗毒素。,以抗毒素对白喉患者进行治疗，发现此种中和毒素的能力能被动地转移给正常动物，使后者获得抗白喉毒素的免疫力，因此称这种方法为人工被动免疫法。此后很多人从免疫动物或传染病病人血清中发现了多种能和微生物或其产物发生结合反应的物质，通称为抗体，而引起抗体产生的物质称为抗原。抗原和抗体因能发生特异性结合，为诊断传染病建立了血清学诊断方法。此二人在1901年共同获得诺贝尔生理和医学奖。,人工被动免疫 采用人工方法向机体输入由他人或动物产生的免疫效应物，如免疫血清、淋巴因子等
8、，使机体立即获得免疫力，达到防治某种疾病的目的。 特点是产生作用快，输入后立即发生作用。但由于该免疫力非自身免疫系统产生，易被清除，故免疫作用维持时间较短，一般只有23周。主要用于治疗和应急预防。,2、抗原,能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。ABO血型：红细胞表面的糖蛋白末端寡糖的特点决定了它的抗原性。,3、抗体是免疫球蛋白,抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。二十世纪三十年代，Tiselius和Kabat用电泳研究血清蛋白。动物免疫后，血清中-球蛋白显著增高。-球蛋白有Ab活性
9、。,4、多克隆抗体的制备 抗淋巴细胞多克隆抗体的制备 采用人的淋巴细胞、胸腺细胞或脾细胞作为抗原，经过处理后接种到异种动物如马或兔体内，使其致敏产生各种针对人的淋巴细胞表面不同抗原决定族的多样抗体，然后再将所采集的动物血清经过一系列的分离、提纯等处理，去除无关的其它杂抗体，从而获得精制的抗淋巴细胞的多种免疫球蛋白（IgG）。,器官移植后的排斥反应是宿主T细胞被外来移植物抗原刺激活化之后所介导的免疫反应。而T细胞的完全活化必须具备三个外来信号，即由抗原提呈细胞（APC）提供的移植物抗原（第一信号）和共刺激因子（第二信号）以及T细胞自分泌或旁分泌的促生长因子（第三信号）。这三个信号的糖蛋白分子都必
10、须与T细胞表面的受体或配体结合，才能传递活化信号，引起T细胞的活化与克隆增殖。,抗淋巴细胞多克隆抗体主要通过阻断抗原与淋巴细胞的结合、杀灭和清除淋巴细胞来实现免疫抑制效应。但由于每批次产品制作所用的抗原（淋巴细胞）不同，或提纯过程的流水线生产差异，不同批次的多克隆抗体产品间存在差异，疗效不一。此外，多克隆抗体对淋巴细胞无关的抗原（包括血小板、红细胞）可发生交叉反应而导致全血象的降低。,PcAb,McAb,基因工程抗体,抗体组药物,利妥昔单抗 Rituximab是1997年美国FDA批准的、用于治疗B细胞非霍杰金氏淋巴瘤，已达30多万例病人。治疗总有效率为50%，其疗效与化学药物相同，但更安全，
11、几乎无副作用，抗体联合化疗有效率高达80%以上。 Rituximab 500mg/支的价格为21000元左右，尽管价格高，但却供不应求，2005年市场销售额近32亿美元。据统计，2005年治疗性和诊断性抗体的销售额大约为150亿美元，治疗性抗体的销售达到120亿美元。,1、单克隆抗体的原理 骨髓瘤细胞在体外培养能无限增殖，免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，细胞融合后形成杂交瘤细胞；HAT培养基选择性培养杂交瘤细胞；微量蛋白质检测技术筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。,4.2 单克隆抗体的制备,2、单克隆抗体的制备过程,抗原制备、免疫动物免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞的选
12、择培养、杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆化,单克隆抗体的检定分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立单克隆抗体的大量制备动物体内诱生法体外培养法单克隆抗体的纯化,1982年，美国斯坦福医学中心的科学家用小鼠制备的单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者的病情缓解、瘤体消失。 1986年，美国FDA批准世界上第一个单克隆抗体药物莫罗单抗-CD3（OKT3）进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。在这个时期，抗体药物的研制和应用给人们治疗疾病带来了很大的期望。20年后的今天，单克隆抗体药物已经成为生物医药最重要的发展领域之一，到2006年，FDA共批准23个治疗性单克隆抗体药物。,OKT3单抗主要和T细胞表面
13、的CD3抗原结合，而CD3分子是与T细胞受体（TCR）紧密相联在一起的一个复合体（TCR-CD3复合体）。这样，OKT3就可通过封闭TCR而阻断由APC提呈的启动T细胞活化的第一信号（外来抗原）的结合。 OKT3的选择性好、特异性强，制剂和疗效较稳定，对急性排斥反应的逆转率可达8595%。,作业1、名词解释： 抗原、抗体、单克隆抗体。2、简述单克隆抗体的制备原理。3、简述单克隆抗体制备的基本过程。,4.3 鼠源性单克隆抗体的改造,杂交瘤单克隆抗体均为鼠源性大量应用于人体可产生人抗鼠抗体改造鼠源性单克隆抗体的目的：降低免疫原性降低相对分子质量，增加组织通透性,一、免疫球蛋白的结构,B淋巴细胞在抗
14、原刺激下增殖分化为浆细胞，浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合的免疫蛋白-Ab。抗体也称为球蛋白。1968年和1972年将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白。,免疫球蛋白分为分泌型（SIg）和膜型（mIg）。SIg主要存在于血清及其他体液或外分泌液中，具有抗体的各种功能。mIg是B细胞表面的抗原识别受体。Ig是由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。,重链的分子量约为5075kD，由450550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸的组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此将免疫球蛋白分为五类，即IgM、IgD、IgG、IgA
15、和IgE，其相应的重链分别为链、链、链、链和链。根据Ig铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，同一类Ig可分为不同的亚类。,轻链的分子量约25 kD，由214个氨基酸残基构成。轻链分为(kappa)型和(lambda)型。天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同。 两型轻链的功能无差异。 不同种属中，两型轻链的比例不同。:比例的异常可能反映免疫系统的异常 -人类免疫球蛋白链过多，提示可能有产生链的B细胞肿瘤。,可变区 ：重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大。 高变区 ：VH和VL各有三个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化。 互补性决定区：三个高变区共同组成Ig的抗原结合部
16、位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面。骨架区：高变区之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化。,恒定区：重链和轻链的C区分别称为CH和CL 。铰链区：位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，易伸展弯曲，易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。,二、免疫球蛋白的功能区,VH和VL是结合抗原的部位。 HVR（CDR）是V区中与抗原表位互补结合的部位。 CH和CL具有部分同种异型的遗传标志。,三、免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶水解片段。2个Fab段：抗原结合片段，由一条完整的轻链和重链的VH和CH1功能区组成，与抗原结合不能形成凝集反应或沉淀反应。Fc段：可结晶片段。Fc段相当于IgG 的CH2和CH3功能区，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。Ig同种型的抗原性主要存在于Fc段。,
