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1、生物化学实验示范报告：3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线；马铃薯总糖含量测定第 1 页 共 4 页实验二 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线马铃薯总糖含量测定实验目的 1. 熟悉并掌握 7200 型分光光度仪的结构及工作原理和操作使用方法；2. 掌握分光光度法测定物质含量的基本操作步骤及微机绘制标准曲线的操作方法；3掌握 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的原理及方法；4掌握 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理与方法。实验原理1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖（葡萄糖）的及标准曲线定制原理3,5-二硝基水杨酸在强碱
2、溶液中与还原糖在沸水浴中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物，该有色物质在 540nm 处有最大吸光度，且在一定浓度范围内（一般 OD 值在 0.20.8 范围内线性较好） ，还原糖的量与反应液的颜色强度（吸光度 OD 值）呈线性关系，利用分光光度仪，以分析纯葡萄糖为还原糖测定的标准品，在 540nm 处按梯度依次测定各葡萄糖浓度对应的反应液的吸光度（OD 值）大小，通过微机处理数据，定制葡萄糖标准曲线，确定出 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的线性回归方程；2. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定马铃薯总糖含量测定的原理先将马铃薯去皮，经机械粉碎，过滤和清水漂洗，烘干制成马铃薯淀粉；
3、再精确称取干燥恒重后的马铃薯淀粉加酸水解为还原糖，经中和定容，配制成马铃薯总糖含量测定的待测液（即样品液） ；再以标准曲线测定的加样操作方法，测定出样品待测液的吸光度大小，将测定的吸光度大小代入其回归方程，即可计算出样品待测液的显色浓度，根据稀释倍数关系，计算出以还原糖的量表示的马铃薯总糖的量，并测定出马铃薯总糖百分含量。该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。实验操作1. 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线（1）葡萄糖标准溶液的配制：（2mg/mL）准确称取 2000mg 分析纯的葡萄糖（预先在 105干燥至恒重） ，用少量蒸馏水溶解后定容至 1000mL，冰箱保存
4、备用（2）葡萄糖标准曲线定制加样操作及测定结果纪录（详见表 1）按表 1 进行实验操作，在沸水浴中准确反应 20min，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，用 lcm 的比色杯于 540nm 处测光密度值。并记录 A540nm 处测得的各浓度及样品对应的 OD值。（3）葡萄糖标准曲线定制微机数据处理和回归方程（详见表 2）及标准曲线的绘制见图 12. 马铃薯总糖含量测定操作（1）马铃薯淀粉的制备（此处略，学生实验报告需补充完整）（2）马铃薯淀粉水解待测液配制（2mg/mL） 准确称取干燥恒重后的自制淀粉 250mg，加入 100mL蒸馏水和 2mL20%硫酸，在沸水浴中加热水解
5、，直到水解彻底后，用 20%氢氧化钠溶液中和，至 pH = 6.87.0 后，将反应液转入 250mL 容量瓶中，补加蒸馏水定容至 250mL，配制成浓度为 2mg/mL 的淀粉生物化学实验示范报告：3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线；马铃薯总糖含量测定第 2 页 共 4 页水解后，即总糖测定的样品液，冰箱保存备用。（3）马铃薯淀粉水解待测液还原糖测定（操作方法详见表 1）表 1 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线实验加样操作记录表试 管 编 号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 样 1 样 22000ug/mL葡 萄 糖 标 准 溶 液 / mL 0.00 0.20 0
6、.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.00 1.003,5-二 硝 基 水 杨 酸 （ mL）蒸 馏 水 （ mL） 2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.42.0mL立 即 摇 匀 放 入 沸 水 浴 中 准 确 反 应 10min取 出 后 用 自 来 水 冷 却 ， 用 蒸 馏 水 定 容 至 25mL后 ， 以 0号 试 管 为 空 白 对 照 ， 在 540nm处 比 色 测 定 OD值 。表 2 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线数据处理统计表0 1 2 3 4 5 6 7 80.0 16.0 3
7、2.0 48.0 64.0 80.0 96.0 112.0 128.00.00 0.084 0.170 0.251 0.314 0.390 0.464 0.526 0.5980.01 0.089 0.163 0.237 0.311 0.385 0.459 0.533 0.607样 1 样 20.363 0.372实 验 数 据 的 相 关 性 因 素 ( r )线 性 回 归 方 程 斜 率 (b)线 性 回 归 方 程 截 距 (a)线 性 回 归 方 程试 管 编 号标 准 葡 萄 糖 显 色 浓 度 ( ug / mL )回 归 方 程 对 应 浓 度 下 的 吸 光 度A540nm实
8、验 测 试 的 吸 光 度0.004630.01444y = 0.00463x + 0.014440.9990生物化学实验示范报告：3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线；马铃薯总糖含量测定第 3 页 共 4 页图 1 3,5-二 硝 基 水 杨 酸 法 定 制 葡 萄 糖 标 准 曲 线0.000.100.200.300.400.500.600.700.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 140.0标 准 葡 萄 糖 溶 液 显 色 浓 度 (ug/mL)A540nm处对应的吸光度(OD值)实 验 实 测 各 散 点 的 平 滑 连 线 回 归 方
9、程 确 定 葡 萄 糖 标 准 曲 线生物化学实验示范报告：3,5-二硝基水杨酸比色定糖法定制葡萄糖标准曲线；马铃薯总糖含量测定第 4 页 共 4 页3. 马铃薯总糖的测定（1）待测淀粉水解液显色浓度的计算：将样品水解液与 DNS 试剂反应后测得的吸光度大小，代入葡萄糖（还原糖）标准曲线对应的回归方程中，计算出水解液的显色浓度 x 显色 （ug/mL） 。（0.372 + 0.363）/2 = 0.00463 x 显色 + 0.01444x 显色 = （0.372 + 0.363）/ （20.00463） 0.01444 = 1983.5（ug/mL ）（2）待测淀粉水解液中还原糖浓度 x 水
10、解 的计算：x 水解 = （0.372 + 0.363）/ （2 0.00463） 0.01444 25 = 1983.5（ug/mL）（3）马铃薯总糖百分含量（以还原糖表示，马铃薯淀粉提取率若为 8.33%）则马铃薯总糖百分含量 w 为：w =(x 水解 /x 样品 ) 8.33% =（1983.5 / 2000 ） 8.33% = 8.26%以下报告内容此处略（学生实验报告需补充完整） 。实验结果分析思考题1. 测定物质含量，定制标准曲线的目的是什么？绘制标准曲线需在图中标示出哪些要素？2、定制标准曲线时如何确定标准品及标准品的浓度使用范围？为什么必需设定空白（参比）管？在一定波长范围内，分别测定物质的吸光度，选择吸光度最大的波长就是物质的特质吸收波长
