郭永龙——纤维素酶动力学研究

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1、纤维素酶动力学研究纤维素酶动力学研究 姓名 郭永龙姓名 郭永龙 班级 生物班级 生物 0808 班班 学号 学号 200807242200807242 指导老师 蔡亚东指导老师 蔡亚东 20112011 年年 7 7 月月 2121 日日 1 纤维素酶动力学研究纤维素酶动力学研究 一 一 纤维素酶纤维素酶的研究背景的研究背景 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称 该酶在食品 医药 轻工 环保等领域的应用日益剧增 前景广阔 通过对产酶机理影响因素的研 究 可确定这些因素在产酶过程中的变化趋势及对产酶的影响作用 从而指导生 产工艺 虽然这方面文献报道较多 但大部分以纯纤维素为底物 如 Ar

2、thur 以 微晶纤维为底物 有的还添加了商品 葡萄糖苷酶 其实际应用价值受到了限 制 本文报道以不脱木质素的植物纤维原料为底物 制备纤维素酶过程中各因素 的变化规律 为木质纤维素的生物利用提供依据 1995 年 Campbell 和 Laherrere 对现有的石油储备以及未开发的石油进行 估计后认为 2010 年以前天然油的产量将开始下降 到 2050 年全球每年的石油 供应量将从目前的 25 亿桶下降到 5 亿桶 随着石化燃料由于短缺变枯竭 能源 是人类面临的共同问题 寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的 生存问题 纤维素与石化燃料不同 它是一种可再生的资源 地球上每年光合作

3、用可产生大于 100 亿吨的植物干物质 其中一半以上是纤 维素和半纤维素 另外 人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素 如农业 废物 稻草 稻壳 麦杆 花生壳 玉米芯 棉籽壳 甘蔗渣等 食品加工废物 果皮 果渣等 木材废物 木屑 树皮 以及城市废弃物 40 一 60 固体废物 是垃圾和废纸 等 如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖 再发酵产生乙醇等能源物质 不仅可以变废为宝 而且还可以避免由于化石燃料 燃烧所带来的环境污染 更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带 来世界性能源危机 纤维素酶的特异性高 反应条件比较温和 可避免化学转化 所导致的环境污染等 是将这些纤维

4、素物质转化成简单糖的关键 因此 在再生 能源利用方面具有很广阔的应用前景 另外 自然界中细菌 真菌 某些无脊椎 动物 直至高等植物中都有纤维素酶的存在 因此 纤维素酶的研究还具有普遍 的生态意义 1 动物内源性纤维素酶的存在 纤维素酶广泛的存在于微生物 植物中已是不争事实 一些真菌和细菌体内 具有复杂的纤维素水解系统 可以有效地水解纤维素 如梭状芽抱杆菌 czostrijiu mtermocezzum 中有多纤维素酶体 在植物中 纤维素酶在植物 发育的不同阶段发挥着水解细胞壁的作用 如果实成熟 蒂柄脱落等过程 对于 动物来说 最初 普遍的观点认为动物自身不含有纤维素酶 那些食木性的节肢 动物以

5、及草食性动物之所以可以以植物为食物来源 是因为其体内含有大量可以 水解纤维素的共生菌的缘故 它们对纤维素的消化主要是依靠其消化道内共生的 微生物 原生动物完成的 这一理论最初由 Cleveland 于 1924 年提出 他在研 究白蚁 Retie uli temesflavipes 时发现 去除后肠中原生动物的白蚁不能 存活 在此后很长一段时间里 人们就用这一理论来解释高等动物为何能消化纤 维素 而之后的很多研究也证明了除了动物消化系统中的原生动物外 其共生的 细菌和真菌也能产生纤维素酶 2 随着对纤维素酶研究的深入 这一理论受到了挑战 1963 年 Marshall 等在 蜗牛 Helixp

6、omaria 无菌的肝胰腺中检测到了纤维素酶和几丁质酶活性 而且还 发现其消化液中纤维素酶和几丁质酶的活性与消化液中菌体的含量无关 此外 还有研究结果表明 高等动物体内很可能存在内源性的纤维素酶 如将白蚁 Leuc otermessperatus 暴露于较高温度中能大大减少其肠道微生物的数量 但同时 肠道中纤维素酶活力却未见明显下降 Scrivener 等研究食木嶂螂 panesthia cribrata 时发现纤维素酶活性只在前肠和中肠中存在 而在有大量原生动物存 在的后肠中却未检测到纤维素酶的活力 将这种嶂螂用含有四环素 能抑制细菌 和原生动物生长 的滤纸喂养 1 2 周后仍未检测到其肠道

7、内纤维素酶活性的下降 并且在此期间其产生的 CO2 和消耗的 O2 之比介于 0 98 和 1 03 之间 表明他们 并没有动用体内储备的营养物质 由此一系列实验证明 食木嶂螂很可能具有内 源性的纤维素降解能力 1998 年 Smant 等用分子生物学的方法 从两种不同种属的植物寄生的线虫 中得到了 4 个内切 B 1 4 一葡聚糖酶 EG 的 cDN A 同年 Watanabe 等利用白蚁 R spertaus 的内切B一1 4一葡聚糖酶的抗血清对其cDNA文库进行免疫筛选 并采用 cDNA 末端决速扩增法 rapid amplification of cDNAends RA CE 得 到白

8、蚁内切 B 一 1 4 一葡聚糖酶 cDNA 从而进一步证明了动物体内确实存在内 源性的纤维素酶 2 一些动物内源性纤维素酶及其基本特性 自 1998 年以来 人们在多种动物体内得到的内源性纤维素酶大都属于内切 B 一 l 4 一葡聚糖酶 例如 两种植物寄生的线虫 Heterodera glycines 和 Globodera rostochinsis 中各分离得到两种 EG 即 HG ENG l HG ENG 2 和 GR E NG l GR ENG 2 并得到了其相应的 cDNA 这 4 种 EG 均属于糖苷水解酶第 5 家族 GHFS 并且其中一个含有细菌式样的纤维素结合结构域 CBD

9、通过基因 组 PCR 的方法得到了全基因 HG eng l 和 G R eng l 含有 8 个内含子 HG eng2 和 GR eng2含有7个内含子 1999年 利用已知的纤维素酶从鳌虾的肝胰腺c DNA 库中得到一个纤维素酶的 cDNA 属于 GHF9 中的成员 并且通过基因组 PCR 的方 法得到了证实 这是从甲壳类中得到的第一个内源性纤维素酶的基因 从白蚁家 族中有代表性的成员 Termitidae 和 Rhinotermitidae 中克隆得到了内源性 EG 的 cDNA 这些 EG 均由 448 个氨基酸残基组成 并且均属于 GHF9 都只含有单一 的催化结构域 通过原位杂交实验

10、证明 Termitidae 中的 EG 来自中肠 而 Rhinor ermiridae 中的 EG 来自唾液腺 从线虫 Meloidogyne ineognita 中分离到了一 个 EG 被命名为 Ml 一 ENGI 它包括一个催化结构域和由富含轻基的氨基酸残 基相连的一个结合结构域组成 它的催化结构域属于 GHF5 CBD 属于第二家族 包括细菌水解酶的 CBDs 它的分子量为 53 4 kD 最适温度 T m 和最适 pHm 分别为 50 度和 5 0 2000 年从一种低等白蚁中分离到一个分子量为 48kD 等 电点 Pl Tm 和 PHm 分别为 4 2 5 0 和 6 0 的 EG

11、它属于 GH F7 成员 主 要包括真菌纤维素酶 它被分成两个亚群 EG 和 CBH 而从其他白蚁中得到的 纤维素酶均属于不含真菌成员的 GHF9 另外 虽然自 1998 年以来 很多动物纤维素酶的基因被克隆 但是可能是于 动物纤维素酶存在着复杂的翻译后修饰 并且这些修饰 如糖基化修饰除对酶的 稳定性有作用外 对纤维素酶的水解活性也有很重要的影响 因此 造成了动物 纤维素酶表达难的问题 到目前为止 最近报道的甲虫 Aprona germari 动物纤 3 维素酶在昆虫细胞中的表达算是最成功 也是为数不多的例子之一 二 二 纤维素酶的应用纤维素酶的应用 2 1在畜牧业上的应用 在牛 猪等养殖中

12、纤维素酶能将饲料中的纤维素降解成可消化吸收的还原 糖 提高饲料的营养价值 利用微生物发酵法生产的纤维素酶可将植物纤维分解 为萄糖 消除饲料中非淀粉多糖的抗营养作用 并降低肠道内容物的黏度 纤维 素酶用作饲料添加剂 能明显提高饲料消化率和利用率 促进动物生长 在奶牛 的养殖上 纤维素酶能增强奶牛食欲 增加其对粗饲料的采食量 提高饲料的消 化率和利用率 提高产奶量 同时 还能降低奶牛消化道的发病率 刘建昌等在 荷斯坦奶牛的配合精料中添加 0 1 质量分数 下同 的纤维素酶制剂 经过 60 d 的试验观察 结果表明添加纤维素酶 每头奶牛日平均产奶量提高了 14 89 在肉牛的养殖上 有研究表明纤维素

13、酶可提高肉牛日增重 缩短育肥周期 增加经 济效益 陈三有等在育肥牛的日粮中 按干物质总量加入 0 3 的 三高一号纤维 素复合酶 使牛平均增重提高 43 研究发现 在基础日粮中添加 0 6 和 1 2 纤维 素复合酶 结果育肥猪增重比对照组分别提高 16 84 和 21 86 在蛋鸡日粮中 添加 0 3 的纤维素复合酶 试验组比对照组的产蛋率提高 8 23 显著地提高了 日粮纤维素和钙的表观消化率 在水产养殖上 吕欣荣发现纤维素酶能破坏植物细胞壁 促进营养物质的消 化吸收 补充内源酶的不足 减少动物肠道有害微生物增殖 减轻或消除饲料抗 营养因子的影响 改善胃中菌群结构及比例 提高机体代谢水平

14、增强免疫力 研究发现 在罗非鱼饲料中添加木聚糖酶 发现此酶能显著促进尼罗罗非鱼的生 长和饲料营养物质的利用 而且 0 1 的木聚糖酶就能满足尼罗罗非鱼的最佳生 长 孙正茂等利用 3 种浓度的葡聚糖浸浴斑节对虾幼虾 发现其显著促进了对 虾的生长 同时 0 5 和 1 的葡聚糖提高了酚氧化酶的活性以及抗菌能力 高春 生等在草鱼饲料中添加 0 1 的纤维素酶 结果发现纤维素酶能有效地提高草鱼 饲料的营养物质消化率 降低饵料系数 提高饲料利用率 2 2纤维素酶在食品工业中的应用 2 2 1用于果蔬汁的生产 如能合理地利用纤维素酶 则有望促进对果蔬汁液的提取和澄清 增加水溶 性纤维的含量 增加膳食纤维在

15、果汁中的比例 提高果汁生产的产量 例如 在 无囊桔子罐头生产中 用纤维素酶处理可促进桔子脱囊衣 在水果汁加工中可促 进果汁的提取和澄清 在保鲜蔬菜加工中可加速脱水等 万日余研究了纤维素酶 在草莓汁生产中的应用 使出汁率提高了 9 2 草莓汁中糖分增加 2 而且 压榨时间缩短 5min 2 2 2用于农副产品的加工利用 植物性农副产品是食品加工业的主要原料 人们食用的部分常是植物细胞的 内含物 细胞壁的主要成分是纤维素 半纤维素和果胶等 恰当地利用纤维素酶 处理后 可使细胞壁发生不同程度的改变 从而改变细胞壁的通透性 提高细胞 内含物 如蛋白质 淀粉 油脂 糖等 的提取率 例如 用纤维素酶处理可

16、促 4 进大豆脱皮 增加从大豆或豆饼中提取水溶性蛋白的得率 在利用水酶法制取玉 米胚芽油的工艺中 纤维素酶能显著提高玉米胚芽油的收率 改善食品质量 简 化食品加工工艺 2 2 3用于速溶茶等新型饮料的加工 速溶茶饮用方便 无不溶渣滓 可以同其他饮料调用 深受国际市场的欢迎 生产上常用热水浸提法提取茶叶中的有效成分 若用沸水浸泡和酶法结合 既可 缩短抽提时间 又可提高水溶性较差的茶单宁 咖啡因等的抽提率 并能保持茶 叶原有的色 香 味 另外 某些蔬菜水果经纤维素酶适当处理后 可使细胞壁 膨胀 软化 提高可消化性 改善食感 土豆 胡萝卜等经纤维素酶适当处理 干燥后 再加水时复原性好 便于蔬菜水果的贮存和运输 2 3纤维素酶在酿酒工业中的应用 白酒酿造所用的原料中 传统工艺采用糖化酶水解 只能将原料中的淀粉水 解使其转化成糖 而大部分纤维质成分则转化不了 被白白浪费掉 在糖化过程 中加入纤维素酶 添加量为 11U g 淀粉出酒率可以提高 1 2 发酵周期可以 缩短 6 h 在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率和原 料的利用率 降低溶液的黏度 缩短发酵时间 而且酒的口感醇香