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1、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 目的 1 掌握血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理 2 掌握电泳对血浆脂蛋白分类方法 类型 3 了解血浆脂蛋白的性质 特点 原理 1 琼脂糖 agarose 是经过挑选 以质地较纯的琼脂 agar 作为原料而制 成的 琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物 琼脂胶是一含有硫酸根 和羟基的多糖 它具有离子交换性质 这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影 响 琼脂糖是直链多糖 它由 D 半乳糖和 3 6 脱水 L 半乳糖的残基交替排列 组成 琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶 电泳时因凝胶含水量大 98 99 近似自由电泳 因为固体支持物的影响少 故电泳速度快 区带整齐 而且由于
2、琼脂糖不含带电荷的基团 电渗影响少 是一种较好的电泳材料 分离效果好 血清中脂类物质是与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白 lipoprotein 形 式存在 各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同 各种脂蛋白颗粒大小也 相差很大 因此 以琼脂糖凝胶为支持物 在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开 来 琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单 将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑 或 油红等 进行预染 再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中 通电后可 以看到脂蛋白向正极移动 并分离出几个区带 2 血清脂蛋白分类 正常人血清脂蛋白可出现三条区带 从阴极到阳极依次 为 脂蛋白 最深 前 脂蛋白 最浅 脂蛋白 比前
3、 脂蛋白略深些 在原点 处应无乳糜微粒 有时前 脂蛋白也显示不出来 按照电泳分类法从前往后依次为 脂蛋白 前 脂蛋白 脂蛋白和乳糜颗粒 3 血清脂蛋白电泳的实质是对血清中的蛋白质进行琼脂糖电泳 并不仅仅是 对脂蛋白进行的电泳 但由于苏丹黑染料只对染疏水性的脂类物质 脂蛋白中含 有大量脂类 因此电泳的结果显示的只是脂蛋白染色带 脂蛋白在血清中含量及 其脂类物质的组成量不同 染色结果带的宽窄 颜色深浅均不同 操作方法一 1 血清制备 空腹抽取正常人的血 迅速移至离心管中 室温放置 1h 左右 3000r min 离心 10 分钟 取血清 注意 雪中加抗凝剂离心得到的为血浆 2 预染血清 取 10m
4、l 血清和 1ml 苏丹黑染色液混合 置于 37 水浴染色 30 分钟 2000r min 离心 10 分钟 取上层溶液 下层残渣弃去 注意 如染色不行 可过夜 3 制备琼脂糖凝胶板 取 1g 琼脂糖 加凝胶缓冲液 200ml 微波炉高温融 化 冷却至 50 60 时 用吸管吸取胶液浇注载玻片不要使其溢出即可 静止至 凝固态 4 点样 将剪好的滤纸条对折 用手捏一捏折痕 使其锋利 距凝胶边缘 2 厘米的地方切一狭缝 用毛细管黏取羽然好的血清点在切口处 稍等片刻 5 电泳 将凝胶板平行放入电泳槽中 两端搭上湿润的纱布 接上电源 每 板电流 3 4mA 直至脂蛋白分出清晰条带为止 操作方法二 1
5、凝胶制备 参照下表比例并适当增减 称量琼脂糖 转入三角坪 没有广 口瓶的情况下 或广口瓶内 加入 TAE 或 TBE 用微波炉或沸水浴中融化 注意 熔化后不要马上开盖 以防水分蒸发 升高凝胶浓度 琼脂糖 0 1g 0 2g 0 4g 0 8g TAE或 TBE 20ml 40ml 80ml 160ml 凝胶浓度 0 5 0 5 0 5 0 5 2 用胶带封住电泳槽两端 插入梳子 水平放置 3 上述凝胶冷却至 50 60 时导入电泳槽 待凝固后 取出梳子 加入适 量电极缓冲液使胶板浸没在缓冲液下大约 1mm 处 注意 拔梳子时要小心 4 样品制备与加样 依据每齿孔大小用微量加样器可加样 5 50
6、 l 不等 注意 样品加在阴极 黑色 一般位于右侧 5 恒压电泳 一般电压为 5 15V cm 对大分子的分离可用电压 5V cm 直至脂蛋白分出清晰条带为止 试剂 1 血清 注意 新鲜的与长期存放的血清 脂蛋白组成不同 2 苏丹黑 将 2g 苏丹黑 B 驾到 60ml 吡啶和 40ml 醋酸酐 混合 放置过夜 再加 3000ml 蒸馏水 乙酰苏丹黑即析出 至布氏漏斗中抽滤 再将滤出结晶物 溶于丙酮 蒸发丙酮 得乙酰苏丹黑粉末结晶 将乙酰苏丹黑粉末溶于无水乙醇 中 使其成为饱和溶液 3 电极缓冲液 称取巴比妥安钠 30 8g 巴比妥 5 52g 及 EDTA 0 29g 加蒸馏 水至 2000
7、ml 4 凝胶缓冲液 称取 2 42g NaCl 11 7g 及 EDTA 0 58g 用蒸馏水稀释至 2000ml 5 琼脂糖凝胶 按下表比例配制 用微波炉或沸水浴中融化 琼脂糖 0 1g 0 2g 0 4g 0 8g TAE 或 TBE 20ml 40ml 80ml 160ml 凝胶浓度 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 器材一 1 电泳槽 2 纱布 3 载玻片 凝胶板 4 毛细管 5 电泳仪 6 滤纸条 器材二 1 电泳槽 2 电泳仪 3 梳子 4 10 50 l 的微量加样器 思考题 1 饭后马上取血染色 电泳后 可观察到脂蛋白有几种类型 2 长期存放的血清电泳脂蛋白能分几条带 为什么 3 为什么 脂蛋白比 脂蛋白染色深
