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1、 Bradford 法测蛋白质浓度法测蛋白质浓度 一一 实验原理 实验原理 考马斯亮蓝 CBB 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种 考马斯亮蓝在 游离状态下呈红色 最大光吸收在 488nm 当它与蛋白质结合后变为青色 蛋白 质 色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收 其光吸收值与蛋白质含量成正 比 因此可用于蛋白质的定量测定 蛋白质与考马斯亮蓝结合在 2min 左右的时 间内达到平衡 完成反应十分迅速 其结合物在室温下 1h 内保持稳定 该法试 剂配制简单 操作简便快捷 反应非常灵敏 灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍 可 测定微克级蛋白质含量 测定蛋白质浓度范围为 0 1 000 g
2、 ml 是一种常用的 微量蛋白质快速测定方法 二二 试剂配制试剂配制 10ml 标准蛋白溶液标准蛋白溶液 浓度 1mg ml 牛血清蛋白 配置 用十万分之一天平称取 0 01g 牛血清蛋白 98 倒入 10ml 容量瓶中 用 0 15M NaCl 溶液定容至 10ml 室温下充分混合溶解 1 小时 10000rpm 离心 半分钟 取上清液 500mL 染色剂染色剂 浓度 0 01 w v G250 8 5 磷酸和 4 75 乙醇 配置 用千分之一天平称取 0 05g G250 于烧杯中 加入 25mL 95 乙醇 使用搅拌子搅拌 再量取 50mL 85 的磷酸溶液 最后去离子水定容至 500m
3、L 配好后用 Whatman1 号滤纸过滤 保存 在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月 但这段时间可能会出现染料的 沉淀 所以每次使用前需混合均匀 二二 保存条件保存条件 保存 在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月 但这段时间可能会出现染料的 沉淀 所以每次使用前需混合均匀 三 实验过程三 实验过程 1 提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪 2 配制蛋白标准溶液 先配制 1 mg ml 的牛血清蛋白 BSA 母液 再往母液中加入磷酸缓冲溶 液 PBS 配制一组浓度分别为 1 0mg ml 0 8mg ml 0 4mg ml 0 2mg ml 0 1mg ml 的 BSA 溶液 100 L 计
4、算稀释各组需要的 BSA 溶液及 PBS 溶液的体积 BSA 体积 ul 0 10 20 40 60 80 100 PBS 体积 ul 100 90 80 60 40 20 0 BSA 浓度 mg ml 0 0 1 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 3 将配置好的不同浓度蛋白标准溶液30 L加到1mL Bradford工作液中 轻轻 颠倒混匀 静止5min 4 将适量体积的样品用PBS稀释至30mL 加入1mL Bradford工作液中 轻轻 颠倒混匀 静止5min 注 样品稀释倍数需要根据原始样品的浓度进行适量调整 一般保证稀释 后样品浓度在0 1 1 0mg ml 所以测浓度之间可以
5、简单的估计一下浓度范 围 一般情况需要稀释10左右 5 将反应好的溶液300 L加入到96孔板的样品孔中 6 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A595nm吸光度 根据标准曲线计算出 样品的蛋白浓度 四 实验数据及处理四 实验数据及处理 测得三次重复实验 BSA 溶液的吸光度如下 编号 吸光度 1 吸光度 2 吸光度 3 平均吸光度 浓度 mg mL 1 0 000 0 000 0 000 0 000 0 00 2 0 127 0 124 0 126 0 126 0 10 3 0 245 0 242 0 248 0 245 0 20 4 0 416 0 418 0 407 0 414 0 40 5
6、 0 566 0 565 0 552 0 561 0 60 6 0 781 0 786 0 768 0 778 0 80 7 0 968 0 956 0 964 0 963 1 00 用Excel或orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线 五 实验结果分析五 实验结果分析 得到的吸光度对 BSA 浓度的关系曲线 R2值大于 0 99 的时数据较好 如果 R2值较小 即测得的吸光度与浓度的线性不是很好 究其原因可能有以下两点 一是移液枪的操作不是很熟练 二是移液枪在移液过程中存在着气泡 使移的液 体体积不准确 注意事项 注意事项 1 由于染料与蛋白质结合的过程 大约只要 2 分钟即可完成 其颜色可以在 1 小时内保持稳定 且在 5 分钟至 20 分钟之间 颜色的稳定性最好 2 Bradford 法的所测的蛋白浓度和 595nm 吸收值的直线变化关系是有一定范围 的 其实包括 bradford 本人也认为用二次曲线关系更合适 但在小范围内 可以当成直线关系 所以采用二次曲线关系 一般都可以使 R 平方达到 0 99 以上 吻合度是非常高的 用于计算蛋白浓度也是非常准确的 3 由于各种原因 每一次测标样的时候都会和以前的标样的结果不太一致 所 以如果对蛋白浓度要求比较严格的话推荐每一次测蛋白浓度前都必须重新测 标样并绘制曲线关系 而不能采用以前的曲线关系进行计算
