《样品非靶向代谢组 分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《样品非靶向代谢组 分析（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 18 代谢组学分析 metabolomics 实验报告 项目名称 委托单位 项目编号 检测人员 核验人员 技术服务部负责人 报告时间 2 18 目录 1 代谢组学实验原理 3 2 项目实验流程 4 3 实验仪器和试剂 5 4 实验方法 5 4 1 样品信息 5 4 2 样本预处理方法 5 4 3 色谱 质谱分析 6 4 4 数据处理 7 5 实验结果 7 5 1 实验质量控制 7 5 2 各组样本的典型代谢谱图 9 5 3 数据分析 11 6 差异代谢物 KEGG 代谢通路分析 17 7 实验结论 17 8 参考文献 18 9 附件总结 18 3 18 1 代谢组学实验原理 代谢组学 me
2、tabolomics 是在后基因组学时代兴起的一门跨领域学科 其 主要目标是定量的研究生命体对外界刺激 病理生理变化 以及本身基因突变而 产生的其体内代谢物水平的多元动态反应 1 代谢组学诞生于上个世纪末 由英 国伦敦帝国大学 Jeremy Nicholson 教授创立 之后得到迅速发展并渗透到多项领 域 比如疾病诊断 医药研制开发 营养食品科学 毒理学 环境学 植物学等 与人类健康护理密切相关的领域 从分析技术的角度来看 非靶向代谢组学是尽可能多地定性和相对定量生物 体系中的代谢物 最大程度反映总的代谢物信息 针对生物样本中小分子代谢物 种类多 极性跨度大和浓度动态范围大的特点 色谱 质谱技
3、术成为代谢组学研 究最重要的工具 LC MS是以高效液相色谱作为分离系统 高分辨率质谱为检测 系统的一种串联分析平台 与其他色谱 质谱联用技术相比 LC MS更适用于分 析难挥发或热稳定性差的代谢物 超高效液相色谱通过应用1 7 m超细粒径填料 填充的色谱柱 比传统HPLC的分析速度至少提高1倍 灵敏度和分离度提高数倍 2 目前 超高效液相色谱与四级杆 飞行时间 Q TOF 质谱联用技术已被广泛 用于代谢组学研究 亲水相互作用色谱 HILIC 是专门针对强极性代谢物而开 发的色谱柱 因拥有和反相色谱 RPLC 互补的选择性而得到广泛重视和应用 研究表明 HILIC ESI Q TOF MS能提
4、供中心碳循环代谢的最大信息量 3 基于超高效液相色谱 Q TOF MS 的非靶向代谢组学分析流程一般包括 样 品预处理 代谢物提取 LC MS 全扫描检测 数据预处理 统计分析及差异物 结构鉴定 本实验采用 HILIC UHPLC Q TOF MS 技术结合数据依赖采集方式对 样本进行全谱分析 同时获得一级质谱和二级质谱数据 随后采用 XCMS 对数 据进行峰提取和代谢物鉴定 简单工作流程见图 1 4 4 18 图1 实验流程图 2 项目实验流程 主要步骤包括 样品制备 QC 制备 样品 LC MS MS 质谱分析 数据分析和实 验报告等 代谢组学技术路线 5 18 3 实验仪器和试剂 Tri
5、ple TOF 6600 质谱仪 AB SCIEX Agilent 1290 Infinity LC 超高压液相色谱仪 Agilent 低温高速离心机 Eppendorf 5430R 色谱柱 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 1 7 m 2 1 mm 100 mm column 乙腈 Merck 1499230 935 乙酸铵 Sigma 70221 4 实验方法 4 1 样品信息 待测样本信息 共 2 组样本 每组 20 份生物学重复样本 样本具体信息见表 1 质控样本 QC 的制备 分别取每个样本 20 L 混合为 QC QC 样本用于测定 进样前仪器状态及平衡色
6、谱 质谱系统 并用于评价整个实验过程中系统稳定性 表1 样品信息 样品分组 样品名称 数量 样品状态 1 Control C 20 液体 2 Tb Tg 20 液体 4 2 样本预处理方法 4 环境下取每个样本 100 L 加入 400 L 预冷甲醇 乙腈溶液 1 1 v v 涡 旋混合 30 s 20 静置 20 min 14000 g 4 离心 15 min 取上清 400 L 真空 干燥 质谱分析时加入 100 L 乙腈水溶液 乙腈 水 1 1 v v 复溶 涡旋 14000 g 4 离心 15 min 取上清液进样分析 6 18 4 3 色谱 质谱分析 4 3 1 色谱条件 样品采用
7、Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统 UHPLC HILIC 进行分 离 柱温 25 流速 300 L min 进样量 2 L 流动相组成 A 水 25 mM 乙 酸铵 25 mM 氨水 B 乙腈 的梯度洗脱程序如下 0 1 min 为 85 B 1 12 min B 从 85 线性变化到 65 12 12 1 分钟 B 从 65 线性变化到 40 12 1 15 min B 维持在 40 15 15 1 分钟 B 从 40 线性变化到 85 15 1 20 分钟 B 维持在 85 整个分析过程中样品置于 4 自动进样器中 为避免仪 器检测信号波动而造成的影响
8、采用随机顺序进行样本的连续分析 样本队列中 每间隔 5 个实验样本设置一个 QC 样品 用于监测和评价系统的稳定性及实验数 据的可靠性 4 3 2 Q TOF 质谱条件 分别采用电喷雾电离 ESI 正离子和负离子模式进行检测 样品经 UHPLC 分 离后用 Triple TOF 6600 质谱仪 AB SCIEX 进行质谱分析 HILIC 色谱分离后的 ESI 源条件如下 Ion Source Gas1 Gas1 60 Ion Source Gas2 Gas2 60 Curtain gas CUR 30 source temperature 600 IonSapary Voltage Floa
9、ting ISVF 5500 V 正负两种模式 TOF MS scan m z range 60 1000 Da product ion scan m z range 25 1000 Da TOF MS scan accumulation time 0 20 s spectra product ion scan accumulation time 0 05 s spectra 二级质谱采用 information dependent acquisition IDA 获得 并且采用 high sensitivity 模式 Declustering potential DP 60 V 正负两种模式
10、 Collision Energy 35 15 eV IDA 设置如下 Exclude isotopes within 4 Da Candidate ions to monitor per cycle 6 7 18 4 4 数据处理 原始数据经 ProteoWizard 转换成 mzML 格式 然后采用 XCMS 程序进行峰对齐 保留时间校正和提取峰面积 代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配 50 的离子峰 采用 Pareto scaling 方法进行归一化 然后应用 MetaboAnalyst 软件进行多维统计分析 包括无监督 主成分分析 PCA 有监督偏最小二乘法判别分析 PLS DA 单维统
11、计分 析包括 t 检验和变异倍数分析 R 软件绘制火山图 5 实验结果 5 1 实验质量控制 采用 QC 样本谱图比对和主成分分析两种方法 对本项目实验中的 8 次 QC 样本 数据进行分析评价 1 QC 样本总离子流图 TIC 的比较 将 8 次分析得到的 QC 样本 UHPLC Q TOF MS 总离子流图 进行谱图重叠比较 见图 2 结果表明各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠 说明在整个实验过 程中仪器误差引起的变异较小 8 18 Intensity of 1 5e8 Intensity of 7 5e7 图 2 1 QC 样品 HILIC 正离子模式 TIC 重叠图谱 IDA Sur
12、vey from QC02 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 QC IDA Survey from QC03 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 QC IDA Survey from QC04 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 QC IDA Survey from QC05 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 QC IDA Survey from QC06 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 QC IDA Survey from QC07 AMIDE NEG w
13、iff sample 1 P15479 QC IDA Survey from QC08 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 QC 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Time min 图 2 2 QC 样品 HILIC 负离子模式 TIC 重叠图谱 2 总体样本主成分分析 PCA 采用 XCMS 软件对代谢物离子峰进行提取 离子峰数目见表 2 将所有实验样本 和 QC 样本提取得到的峰 经 Pareto scaling 后进行 PCA 分析 如图 3 所示 QC 样本 绿色
14、 紧密聚集在一起 表明本项目实验的重复性好 表 2 保留峰数目 样品分组 峰数目 HILIC 正离子 3635 HILIC 负离子 5069 9 18 Intensity of 7 2e7 图 3 正 负离子模式下样本的 PCA 得分图 综上所述 本次试验的仪器分析系统稳定性较好 试验数据稳定可靠 在试验中 获得的代谢谱差异能反映样本间自身的生物学差异 5 2 各组样本的典型代谢谱图 C 和 Tg 组的样本经 UHPLC Q TOF MS 分析后得到的典型 TIC 图谱 如图 3 所 示 IDA Survey from C2 AMIDE POS wiff sample 1 P15479 C2
15、100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time min 图 3 1 C2 样本 HILIC 正离子模式 TIC 图谱 10 18 Intensity of 1 9e8 Intensity of 8 0e7 Intensity of 1 6e8 IDA Survey from C2 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 C2 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time min 图 3 2 C2 样本 HILIC 负离子模式
16、 TIC 图谱 IDA Survey from Tg1 AMIDE POS wiff sample 1 P15479 Tg1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time min 图 3 3 Tg1 样本 HILIC 正离子模式 TIC 图谱 IDA Survey from Tg1 AMIDE NEG wiff sample 1 P15479 Tg1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time min 图 3 4 Tg1 样本 HILIC 负离子模式 TIC 图谱 11 18 5 3 数据分析 对代谢组学数据进行分析的首要目标是从鉴定到的大量代谢物中筛选一部分具 有统计学和生物学意义的代谢物 并以此为基础阐明生物体的代谢过程和变化的 机制 很多情况下 鉴定到的代谢物之间表达量和表达模式是有一定相关性的 例如处于同一代谢途径上下游的代谢物 5 3 1 数据检查与归一化处理 数据的完整性和准确性是后续获得具有统计 学和生物学意义的分析结果
