rtca技术原理及应用

《rtca技术原理及应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《rtca技术原理及应用（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、郑敏 xCELLigence技术的原理及其应用简介 杭州高通量新药筛选中心浙江大学医学院附属一院 简介传统基于细胞水平的研究方法的局限性ACEA公司的解决方法技术平台 基于微电子传感器技术 通过实时监测阻抗的变化来进行实时的细胞分析操作原理 实时细胞分析我们监测的指标xCELLigence系列产品RTCA检测的特点应用范例独特的应用 RTCA心脏系统总结 RTCA技术的优势 xCELLigence技术介绍大纲 传统细胞毒性 活力检测方法工作原理及检测流程 细胞 培养 MTT CVKT 加入MTT 孵育 加入有机溶剂 孵育 加入CVTK 孵育 测吸光度 数据处理分析 单个时间点信息结果反复 不稳

2、定新的未知蛋白 药物 基因的作用难以优化条件耗费大量时间 经费重复实验 优化条件没有直观信息做问题分析 DNADamaging DNADamaging RTCA实时动态监测细胞毒性反应检测流程 细胞接种 细胞增殖 外界因子加入 细胞效应 RTCA MTT 实时 无标记 全自动 细胞毒实验 传统终点VS实时无标记检测 微电子阻抗感应器在细胞生物学中的应用 Z Z Z0 Z Zcell AddCells electrodeswithoutcells 检测原理基于微电子阻抗技术的细胞检测技术 Z 细胞指数和细胞数的关系 16000 8000 500 1000 2000 4000 125 250 Ce

3、llNumber CellNumber CellIndex 8 3 4 6 1 9 0 9 0 51 0 3 0 22 0 13 CellIndex 0min 5min 20min 细胞指数和细胞粘附力及形态的关系 xCELLigence系统系列产品 RTCA1 96 RTCA6 96 RTCA3 16 CIM RTCA1 384 RTCA RTCAHTSystem RTCACardioInstrument xCELLigence系统系列产品的匹配电子板 时间点选择在细胞试验中重要性 不同的细胞状态对于处理因素有不同的反应RTCA系统使接种细胞后的对于细胞的检测可持续进行RTCA为最佳处理时间

4、的选择提供了依据 TraditionalCellAnalysisMethod RT CAAssay 不同时间点肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应性 Vehicle33nM67nM100nM150nM230nM340nM500nM xCELLigence系统的应用 细胞增殖和细胞毒性试验细胞贴壁和铺展受体 配体间相互作用RTKsGPCRsIgEreceptorNK细胞介导的杀伤肿瘤细胞肿瘤细胞的迁移和侵袭siRNA文库筛选心脏细胞功能和毒性监测病毒CPE及中和实验的监测细菌毒素介导的细胞病变的监测 利用xCELLigence系统进行细胞质控 A549 PC3 HeLa 细胞生长曲线来源于4个不同的实验室

5、和ATCC ATCC Lab1 Lab2 Lab3 Lab4 Theselabswerefromthesameinstitute 应用xCELLigence系统研究TCRP Staurosporine 5 Fluorouracil TimedependentcellularResponseProfiling TCRP时间依赖的细胞反应特征性图谱 TCRPwithKnownMechanisms Short TermResponse Long TermResponse Anti mitotics Protein Synthesis DNADamaging NuclearHormone HDACIn

6、hibitors SerotoninReceptorAntagonist L TypeVoltage gatedCaChannelInhibitor Anti Histamine Short TermResponse Long TermResponse Anti mitotics Protein Synthesis DNADamaging NuclearHormone HDACInhibitors SerotoninReceptorAntagonist L TypeVoltage gatedCaChannelInhibitor Anti Histamine TCRPwithKnownMecha

7、nisms 利用TCRP进行药物筛选 Seed4000A549CancerCellsin96wellE Plates TreatwithCompoundsatafinalconcentrationOf20mM Monitorthecellularresponsefor48hours Comparecytologicalprofiles E Plate AddCells AddCompound Real TimeContinuousMonitoring Monitor20 24hours Monitor48hours Impedance basedreal timecellularrespons

8、eprofile Interdigitatedgoldmicroelectrodes SpectrumCompoundLibraryfromMSDiscovery CollectionofFDAapproveddrugs naturecompoundsExperimentalcompounds insecticidesandherbicides ACEABiosciencesConfidentialInformation ACEABiosciencesConfidentialInformation 0110 TCRP聚类分析 ACEABiosciencesConfidentialInforma

9、tion 0110 TCRP聚类分析 RTCA技术的优势 无需标记可以节约因标记带来的时间和花费不改变研究对象的性状 使研究过程更为简便及实现自动化不需要知道明确的作用靶点 可实现多功能的检测实时动态监测 高质量 更多的信息量Newinsightsfromeasy to achievekinetic real time measurements 持续的细胞质控非创伤性的检测 更接近生理状态检测后的细胞还可用于其他的检测方法准确性高 可针对不同通量检测 实时无标记细胞表观分析在肿瘤研究中的应用 增殖及细胞毒性迁移及浸润肿瘤与微环境 共培养信号通路肿瘤免疫 细胞免疫 肿瘤分子机制研究及治疗探索的细

10、胞学基础 分子机制研究 治疗探索 实时无标记细胞功能分析 RTCA 27 应用专辑一案例 图1A RTCA实时动态检测细胞活力 HeLa细胞接种于E Plate96电极板 培养24h之后用不同化合物处理 MG 132 3 3 M 阿霉素 0 33 M 长春新碱 6 2nM 及5 FU 11 1 M 未经化合物处理的细胞作为对照组 每隔15min检测一次细胞指数 持续检测64h 曲线代表所有重复样品的平均值 误差线为标准偏差 图1B 细胞指数和WST 1分析结果对比 实验结束时 图1A所示 即加药后64h 加WST 1染色分析 细胞指数和WST 1分析结果对比 结果展示为试验组相对于对照组的倍数

11、变化 柱状图显示所有重复样品的平均值 误差线为标准偏差 此图给药组曲线刚刚为零时 测定凋亡的结果较好 此例的切入点是我们的仪器可以通过完整的药时曲线 帮助选择流式检测凋亡的最佳时间点 提高流式检测凋亡的效率及准确性 应用专辑一案例 RNaseL高表达抑制细胞增殖 在低表达核糖核酸酶RNaseL的Hela细胞系中稳转RNaseL基因构建成高表达RNaseL的Neo RNaseL克隆细胞 稳转空载Neo作为对照组 将两类细胞系5x103 孔接种至96xE Plate上 设4个副孔 RTCA实时动态动态监测细胞增殖情况 每隔20min检测一次 持续检测5天 结果显示 核糖核酸酶RNaseL过表达抑制

12、细胞增殖 此例说明对于转染目的基因到对象细胞中考察对细胞增殖影响 传统方法需要在筛选1 2周后 重新增殖到数量够铺96孔板 大概需要1 2周时间 这段时间转染后的细胞可能会发生变化 结果不准 那么我们的仪器最低只需要125cell well 因此可以在筛选后 直接铺细胞进行增殖实验 因此 可以省下一半的时间 而结果准确 浸润与转移是恶性肿瘤两大特点 浸润与转移的可能机制肿瘤细胞同质型粘附力降低瘤细胞异质型粘附力增加细胞外基质降解瘤细胞的运动能力肿瘤转移相关基因及抑制基因局部组织器官的特异性 30 肿瘤细胞的迁移和浸润 侵袭 肿瘤转移过程中的细胞迁移过程 迁移的途径 淋巴道血道种植性转移转移的发

13、生与否 常被视作癌症患者病程的严重程度以及治疗效果的指标肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因 31 与现有方法的对比 ConventionalTranswellAssay RTCAMigration InvasionAssay 大大简化实验步骤实时定量检测细胞迁移 浸润 传统方法的缺陷 操作繁琐 实验的影响因素增多 导致实验的重复性不好人工计数 结果受主观因素影响大 结果不客观检测时间点少 无法描述迁移的完整变化 可能月遗漏重要实验结果 RTCA实现肿瘤细胞迁移浸润实时高效率检测 检测流程 33 RTCA研究小分子的细胞迁移抑制作用 34 此例可以对比transwell与我们CIMplate的

14、价格区别 如上图 做这个药物的抑制迁移的IC50 我们的CIM板 一块16个孔就能完成 800元 然而 transwell考察3个时间点 每个药物剂量做3复孔 按照每孔40元 共需要2880元 MicroRNA 200crepressmigrationandinvasionofbreastcancercellsbytargetingactin regulatoryproteinsFHOD1andPPM1F MolCellBiol 2012Feb 32 633 51 结合microRNA及siRNA调控的细胞迁移检测 RTCA实时检测microRNA作用下的细胞迁移 35 DouglasHana

15、hanandRobertWeinberg Cell144 646 674 肿瘤微环境 肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌 改变和维持自身生存和发展的条件 促进肿瘤的生长和发展全身和局部组织亦可通过代谢 分泌 免疫 结构和功能的改变 限制和影响肿瘤的发生和发展对于认识肿瘤的发生 发展 转移等有着重要的意义 而且对于肿瘤的诊断 防治和预后亦有着重要的作用 36 共培养系统是一个平台 它的应用领域很灵活 可以随意开展实验 只要是想研究两种细胞相互影响 就可以用我们的共培养系统需要指出的是 我们的上室 insert 是独立的 适用于目前我们在销售的任何一款板子 无论是E plateL8 16 96 38 应用

16、专辑一案例 信号通路 RTCA在内源性GPCR信号通路研究中的应用 G 偶联蛋白受体 GPCRs 即7 跨膜蛋白 是当今临床与科研药物的单一治疗靶点 也是迄今为止发现的最大的靶点家族 据推测 人类基因组中该家族的功能成员超过300个 涉及到多种不同细胞与组织间的广泛信号途径 研究证实 GPCR功能的研究 有助于免疫学 神经病学 心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的治疗 RTCA技术VS传统GPCR测定方法 RTCA技术只需将细胞接种于含有微金电极的培养板上 即可对GPCR激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定 客户提出的问题 1 你们与钙流方法的差异钙流是测定的离子通道 是亚细胞水平测定方法 不能给出细胞水平的变化 然而细胞水平才真正具有生理学意义 我们的产品指示的是细胞水平的变化 2 你们的产品是否有现成的应用我们的用户已经开展了很多GPCR的研究 有一定的技术积累 我们可以为客户提供经验及技术的帮助 应用实例二 肿瘤免疫 细胞免疫 45 肿瘤免疫 tumorImmunology 是研究肿瘤的抗原性 机体的免疫功能与肿瘤发生 发展的相互关系 机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿