《凝血酶-抗凝血酶复合物检测方法建立及初步应用资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凝血酶-抗凝血酶复合物检测方法建立及初步应用资料（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上海第二医科大学 硕士学位论文 凝血酶 抗凝血酶复合物检测方法建立及初步应用 姓名 陈红兵 申请学位级别 硕士 专业 临床检验诊断学 免疫学测定 指导教师 罗伟 2002 5 1 凝血酶一抗凝血酶复合物检测方法的建立及其初步临床应用 中文摘要 凝血酶一抗凝血酶复合物 t h r o m b i n a n t i t h r o m b i nc o m p l e x T A T 是 体内凝血酶原激活成凝血酶 t h r o m b i n Z 后 迅速被抗凝血酶 a n t i t h r o m b i n A T 结合 生成共价键相连的无活性不可逆复合物T A T 由 此维持凝血一抗凝
2、血之间的生理平衡 目前认为该复合物的形成是凝血酶 生成的直接证据 标志凝血系统的激活 检测T A T 的血浆水平可以监测凝 血系统的激活情况 是研究生理病理状态下凝血系统行为的一项有用指 标 一 一 T A T 在形成过程中 凝血酶裂解抗凝血酶的A r 9 3 9 3 S e r 3 9 4 位肽键 并以凝血酶丝氨酸活性中心S e r 2 0 5 结合抗凝血酶的A r 9 3 9 3 位 两者构象 均发生一定的改变 呈现出一定的新抗原表位 因此 用T A T 免疫小鼠来 制备单克隆抗体可以得到针对T 时减少与T A T 前体分子的交叉反 利用肝素一S e p h a r o s eC L 一6
3、 B 高和特异性好的单克隆抗体 同 柱从人血浆中提取凝血酶和抗凝 血酶 然后两者按一定比例体外反应 即可得到浓度和纯度均较高的T A T 复合物 同时含有少量A T 和多余的凝血酶 以该反应的混合物免疫小 鼠 我们制备了一系列特异和非特异针对T A T 的单克隆抗体 并得到了特 对A T 和特异针对凝血酶的单抗 经过抗体配对试验 用针对T A T 的凝血酶部位的 号单抗作捕获抗 体 用针对T A T 之抗凝血酶部位的 号抗体作酶标检测抗体 建立了检测 T A T 的双抗体夹心法酶联免疫吸附试验 该法的线性检测范围为 0 4 6 3 O L L g L 批内c V 为3 9 一5 9 批间c V
4、 为9 1 一1 3 3 回收率为 9 2 6 一1 0 4 9 加入2 0 g m l 的A T 和凝血酶原对T A T 检测无影响 检测 5 0 例含高 中 低值的血浆标本 与用美国D A D E 公司的试剂盒检测的结 果比较 两者相关系数为0 9 6 9 具有非常显著的意义 P 3 0 活性 3 0 0 U m g 牛血清白蛋白 B S A B o e h r i n gM a n n h e i mG M B H 产品 硼氢化钠 N a B H M e r c k 公司产品 其他试剂均为进口分装或国产分析纯 1 3H R P 标记反应液 需现配 0 0 6 m o l L 过碘酸钠液
5、0 1 6 m o l L 乙二 醇液 p H 9 50 0 5 m o l L 碳酸盐缓冲液 5 m g m l N a B H 液 包被液 p H 9 6 0 0 5 m o l L 碳酸盐缓冲液 洗涤液 含0 1 T w e e n 2 0 p H 7 20 0 2 m o l L P B 缓冲液 封闭液 含O 5 B S A 及5 蔗糖的p H 7 20 0 2 m o l LP B 缓冲 液 稀释液 含0 i m o l Lt r i s 0 1 m o l LE D T A 二钠盐 1 T w e e n 2 0 O P D 底物液 p H 5 O 柠檬酸一磷酸盐缓冲液 含0 0
6、1 5 H 2 0 2 4 储存 临 用前加入O P D 0 4 m g m 1 1 4 酶标板为N U N C 公司产品 E l x 8 0 0 型酶标仪为B i o T e k 公司产品 i 5 进口T A T 检测试剂盒为德国b e h r i n g 实验室产品 美国D A D E 公司经 销 其应用兔抗人凝血酶多抗包被酶标板 用兔抗人A T 多抗结合辣根过氧 化物酶作显色抗体 建立双抗体夹心法来检测T A T 2 方法 2 1H R P 标记单克隆抗体的制备采用改良过碘酸钠法 1 称取5 m g H R P 于 试管中 加0 5 m l0 0 6 m o l L N a I O 液
7、置室温3 0 m i n 以终止氧化 可观察 到液体由绿色变为棕色 滴加以辛酸法纯化的5 m g m 1 单克隆抗体I m l 边加边摇匀 充分混匀后将上述溶液装入透析袋中 对p H 9 50 0 5 m o l L 碳酸盐缓冲液搅拌透析过夜 使H R P 和抗体蛋白充分结合 加入5 m g m l N a B H 4 液0 2 5 m i 4 C 放置2 小时 滴加等量p H 7 8 饱和 N H 4 2 S 0 4 液 边加边摇匀 4 C 放置3 0 m i n 后 以3 5 0 0 r p m 离心3 0 m i n 弃上清 沉淀以 5 0 N H 4 2 S 0 4 液洗一次 离心 取
8、沉淀溶于少量p H 7 4O 0 2 m o l L P B 中 对p H 7 4O 0 2 m o l LP B 透析二次 即得纯化的酶标抗体 加等量甘油 混匀 置 2 0 保存待用 2 2 酶标抗体质量检测检测酶标抗体A 2 8 0 n m 及A 4 0 3 值 根据以下公式计 算酶与抗体的克分子比值E P 酶量 m g m 1 A 4 0 3 X 0 4 I g G 量 m g m t A 2 8 0 n m A 4 0 3 0 3 0 6 2 E P 酶量 4 I g G 量 2 3 抗体配对选择以p H 8 O0 0 2 m o l LT r i s H C l 缓冲液将抗T A T
9、 系列单 抗以1 0 ug m l 浓度分别包被酶标板 每孔1 0 0 ul 置4 2 4 小时 取出 拍干 以封闭液封闭过夜 取出 以洗涤液洗三次 拍干待用 每系列分 别加抗原稀释液5 0 ul 再加正常血浆 含2 ug 1T A T 进口T A T 试剂盒 定量 含4 0 ug 1T A T 的血浆 进口T A T 试剂盒定量 5 0 ul 3 7 C 温育 1 5 h 取出洗三次 每孔加l 5 0 0 稀释的H R P 一抗T A T 单克隆抗体结合物 1 0 0 u1 3 7 温育1 h 取出 洗涤4 次 每孔加1 0 0 t l1 邻苯二胺 O P D 4 m g m 1 底物液 3
10、 7 C 避光显色1 5 m i n 以Z m o l LH 2 S 0 4 每孔2 5 ul 中止 反应 置酶标仪上波长4 9 0 h m 处比色 2 4 双抗体夹心法的建立及评价 2 4 1 抗体工作浓度的选择采用棋盘滴定法 选用经抗体配对试验选择 出的最佳配对抗体进行实验 包被抗体采用第 号单克隆抗体以21 g m l 5ug m 1 1 0ug m l 2 0 1 1 g m 1 四个浓度包被 酶标抗体采用I I I 号 抗体 以正常人血浆稀释T A T 为2ug L 4 0ug L 两个浓度 实验方法同 抗体交叉配对试验 2 4 2 线性范围将以D A D E 公司T A T 试剂盒
11、定量的自制T A T 反应混合物 以正常人血浆 T A T 含量为2 ug L 稀释至终浓度6 3ug L 3 8ug L 2 0 ug L 1 lug L 6 5ug L 4 5ug L 2ug U 每孑L 力口5 0ul 再于每 孔加抗原稀释液5 0 u1 混匀 3 7 温育1 5 h 取出洗三次 拍干 加 1 1 0 0 0 酶标抗体每孔1 0 0 ul 3 7 温育1 h 后取出 洗四次 拍干 加 O P D 应用液1 0 01 l2 5 避光显色1 0 1 5 m i n 以2 m o l LH 2 S 0 4 每孔2 5ul 中 止 置酶标仪上4 9 0 h m 处比色 以T A
12、T 值对吸光度值作直方图 2 4 3 重复性取高 4 0 0ug L 中 2 0 0ug L 低 4 5ug L 2 0ug L 四份T A T 浓度的血浆标本于同一批内各测定1 2 次 计算批内 C V 在不同检测日各测定1 0 次 计算批间C V 2 4 4 回收试验于三份正常血浆标本中各加入系列浓度的T A T 4 5u g L 1 1 0ug L 3 6 0ug L 行夹心法E L I S A 测定 计算回收率 2 4 5 干扰试验向2 份血浆标本中分别加入终浓度2 0 u g m l 的凝血酶原 和抗凝血酶 于加入前和加入后分别进行E L I S A 测定 以考察它们是否对 T A
13、T 检测形成干扰 2 4 6 与进口试剂盒的相关性以本方法和D A D E 公司T A T 检测试剂盒同 时对5 0 份临床及正常人 献血员 征兵体检者 血浆标本进行测定 考察 两者的相关性 2 4 7 检测方法的操作步骤以O 0 2 m o l Lt r i s H C lp H 8 0 缓冲液将 号 抗体稀释至1 0 1 1g m l 包被N U N C 板2 4 小时 再以封闭液封闭过夜 弃 去孔中液体 吹干待用 用前用洗涤液洗2 次 加抗原稀释液5 0 u1 孔 再各加血浆标本5 0 u1 孔 混匀 3 7 C 温育1 5 h 洗涤4 次 加 1 i 0 0 0 第m 号酶标抗体1 0
14、 0u1 孔 3 7 C 温育1 h 洗涤4 次 加O P D 应 用液i 0 0ul 孔 3 7 反应l O m i n 加2 m o l L H 2 S 0 42 5ul 中止反应 4 9 0 n m 处比色 2 4 8 统计分析 各测定组测定结果以i s 表示 本法和进口试剂盒相关性检验采用 M i c r oE x c e l 相关分析 结果 1 酶标抗体质量检测以H R P 标记了1 2 株针对T A T 的单克隆抗体 酶标 抗体的E P 比值见表1 2 抗体配对选择结果见表2 以 号抗体为包被抗体 以 I 号抗体作显 色抗体可达最佳效果 表2 抗体配对实验结果 1 I I I I
15、V o 1 2 8o 3 3 7o 6 3 5o 6 4 3 o 3 6 2o 3 1 5o 3 8 5o 5 3 5 o 1 5 20 6 7 lo 8 0 4o 6 1 9o 8 5 61 0 2 20 7 9 61 0 0 7 一 o 3 5 4o 4 9 8o 5 7 3o 1 2 4o 2 4 6o 3 7 3o4 4 0 o 5 5 0o 9 9 2o 8 4 5o 3 3 2o 3 5 8o 5 0 31 1 l l o 1 2 5o 5 5 91 1 0 1o 3 4 50 3 4 2o 3 3 5o 8 0 7l3 4 6 o 2 5 41 5 8 01 2 2 00 8 7
16、 51 3 5 61 2 2 01 6 3 21 5 2 5 o 4 3 6o 3 6 3o 3 9 5o 6 0 4o 1 4 2o 1 5 6o 3 2 8o 4 5 5 o 6 9 6o 4 4 5o 6 2 8o 9 9 7o 4 4 8o 6 6 7o 3 7 01 3 1 9 O 1 5 4 一 o 3 5 7 O 3 2 1o 3 2 6o 3 6 6o 1 5 6o 3 2 4o 3 4 6 o 6 7 9o 5 6 3o 6 6 0o 5 8 2 o 3 3 51 2 4 4 o 1 1 3o 4 4 4 一 o 3 2 2o 8 9 6 o 4 8 6o 3 3 0 o 2 2 5o 5 5 4O 5 5 4 o 5 3 7o 7 8 5o 7 8 81 1 7 0 1 1 7 0 o 1 5 4o 4 0 7o 4 9 4o 5 6 8 o 2 3 2o 2 1 3o 3 2 6o 2 6 8 B0 4 1 80 7 4 7 0 8 6 30 8 1 20 7 8 6 0 6 6 80 6 1 0 0 7 8 0 A0 3 3 00 5 6 3 0 2 1 5 0
