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1、实用组织化学技术 细胞化学和组织化学cytochemistryandhistochemistry是以细胞学 组织学为基础 运用物理的和化学的技术方法显示细胞组织结构中各种化学成分 并对这些化学物质进行定性 定位 定量 半定量 从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢 机能及形态变化规律 其在医学研究中具有广泛的应用价值 细胞和组织化学方法其原则上是运用已知的化学反应过程使细胞组织内的各种化学物质在原位形成可见的最终有色产物 光学显微镜观察 显微镜细胞组织化学电子显微镜观察 电镜细胞化学免疫技术方法 免疫组织化学免疫电镜细胞化学用细胞和组织化学方法显示细胞组织结构中各种酶的定性 定位 定
2、量 酶组织化学酶组织化学 宏观酶组织化学光镜酶组织化学电镜酶组织化学 小脑挫伤 苏木素 伊红染色 HE 酶组织化学染色 脱氢酶 NBT NBT 酶组织化学染色 SDH 细胞和组织化学方法研究的范围1 组织细胞中的无机物质 主要包括钾 钙 锌 铜 汞等金属 氯化物 磷酸盐等盐类 以及各种无机放射性物质等 2 组织细胞中的有机物质 主要包括中性脂肪 磷脂类 胆固醇 中性和酸性粘多糖类 糖原 粘液蛋白 淀粉 类淀粉物质 黑色素 脂褐素 胆色素 氨基酸 肽 蛋白质 DNA RNA 各种维生素等 3 组织细胞中各种酶类 如碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 胆碱酯酶 细胞色素氧化酶 琥珀酸脱氢酶 乳酸脱氢酶等 蛋白
3、质 细胞和组织化学方法的特点 1 必须最大限度地保存细胞和组织中各种化学成分和 或酶的活性 以保证定性 定量研究 2 必须最有效地保持细胞组织固有的形态结构 以保证化学成分和各种酶在细胞组织中的定位 3 必须掌握被检测的化学物质特性 如水溶性 脂溶性 溶解度及特异反应等 4 必须掌握被检测各种酶的特性 如酶的功能 酶存在的特定部位 酶反应的适宜温度和酸碱度 酶的特异激活剂和抑制剂 影响酶活性的因素等 5 必须做对照实验 借助阳性和阴性对照 正确分析实验结果 注意识别假阳性结果 细胞和组织化学方法的基本技术 取材固定水洗脱水透明浸蜡与包埋切片染色 脱蜡 脱苯 水化 染色 脱水 透明封片 一 取材
4、 基本要求 取材是否正确 恰当 直接影响切片的制作及正确诊断 1 取材越快越新鲜越好 防止组织自溶 腐败 2 取材刀要锋利 切取时刀口垂直地切取 严禁挤压 严禁用钳镊钳夹 以免使组织或细胞变形造成人为的损伤 3 取材大小 一般长l 3厘米 宽1 2厘米 厚度为0 3 0 5厘米 科研用光镜标本不超过1cm 1cm 1cm 电镜标本直径约0 5mm 过大材料在短时间内不易固定透 影响效果 4 要兼顾病变部位与正常部位 5 尽可能在低温条件下操作 0 4 各器官取材方法 脑 取材应能反应出脑各部位的变化 一般采用冠状切面法 全脑包括 桥脑 延脑 小脑和脊髓颈段及脉络丛 取材部位如下 额极 中央前后
5、回 海马 内囊 丘脑 枕叶 脉络丛 中脑 桥脑 延髓 小脑 脊髓颈段 取材时要包括软脑膜 室脑膜或软脊膜 刀要锋利 垂体 取垂体时注意前 中 后叶和垂体柄都要兼顾 从前向后纵切 心 一般悄况下将心房 瓣膜 心室一起取下 也可分别取一块病变部位连同正常组织 也可单独取心室肌 乳突肌组织 肺 常规取材应包括左 右两肺 五个肺叶 可根据病变需要决定取材块数 特殊情况下为区别在哪个肺叶上取的材可用形状做标志 在记录时记清楚 肾 取材包括被膜 皮质 髓质和肾盂 并要求区别左 右肾 胰 常规取胰体部 为长方形必要时加取胰头 胰尾 肝 取长方形或三角形均可 带被膜 脾 取材带被膜 管腔脏器 取材时注意方向大
6、 小肠 考虑环行肌肉 沿肠管的长轴取 纵切 食管 以横切面为宜 胃 常规取材以胃底为好 气管 横切 纵切均要有 总之管腔脏器的各层构造都要取到 为了防止标本入固定液后变形 将材料取下后 如剪开的大小肠 胃等组织 将浆膜面铺在滤纸上 然后入固定液内 这样能防止或减少组织受压变形与收缩 二 组织固定 组织固定的意义 组织固定是做好切片的重要步骤之一 如果首次固定失败 再重新固定也不如一次固定成功好 无法补救 处死动物立即取材 这时组织及细胞在一定时间内仍然延续着生命活力 迅速将其固定能有效地防止组织及细胞发生死后的一系列变化 固定的关键在于取材后尽可能地及时地将取到的材料进行固定 抑制其死后变化的
7、进展 尽力使组织接近于生前状态 另外 在标本制做过程中经过许多步骤 为了防止组织成份的溶解消失 有必要及时转变为不溶性物质 从而有利于保存 组织固定的目的 阻止死后变化 防止组织的自溶与腐败 使组织的结构保存下来 如蛋白质 脂肪 糖元 酶等各种成份与生活时的形态相仿 便于染色 同时对组织有媒染作用 使不同的组织成份对染料有不同的亲和力 使细胞各部易于受色 能使组织硬化 为做薄切片打下基础 组织固定的注意事项 材料块不能过大 固定器皿不易过小 固定液量不易过少 大约是固定材料体积的20 40倍 根据检验目的不同选择不同固定液 如做糖元检查就不能用含水的固定液 做电镜检查就必须用锇酸固定液等 固定
8、液 用以固定组织的药剂 固定液分为两大类 单纯固定液 仅由一种药剂组成 混合固定液 或复合固定液 由二种以上的药剂组成的固定液 固定液选择标准 具有强的穿透力 固定均匀 能迅速渗透组织内部 使组织细胞结构保持生活时期的相仿状态 不使组织过度收缩与膨胀而变形 能迅速使组织中的蛋白质 糖 脂肪等物质凝固而成为不溶性物质 使组织达到一定的硬度 便于切片制作 染色 价格便宜 容易买到 同时要配制方便 常用的单纯固定液乙醇 酒精 alcohol甲醛 福尔马林 缓冲液配制 formalin重铬酸钾potassiumbichromate苦味酸picricacid锇酸osmicacid丙酮acetone冰醋酸
9、glacialaceticacid多聚甲醛缓冲固定液paraformaldehyde戊二醛磷酸缓冲固定液glutaricdialdehyde 1 乙醇 酒精 Alcohol它是一种还原剂 不能与氧化剂混合使用 固定用酒精最好浓度在70 80 酒精浓度愈大 组织收缩愈严重 反之 浓度太低起不到固定作用 由于酒精能沉淀白蛋白 球蛋白和核蛋白 而后者的沉淀物易溶于水 所以用酒精固定的标本细胞核染色不佳 酒精还可溶解脂肪 血红蛋白和多种色素 所以做脂肪染色必须要用冰冻切片 乙醇优点 使用方便 经济 国内市售有 95 的乙醇和无水乙醇 100 能硬化组织 起固定作用 也是一种最常用的脱水剂缺点 穿透力小
10、 由于表面硬化 固定液不容易渗透到组织中去 所以用乙醇固定的组织材料要小 组织收缩严重 染色效果一般 2 甲醛 福尔马林 formalin是一种还原剂 不能与氧化剂混合使用 它是一种最常用的固定液 可应用于组织学 酶组织化学 免疫组织化学等染色 最好临用时现配 目前认为甲醛是一种致癌剂 致畸剂等 甲醛液是一种无色透明极易挥发有强烈刺激性气味的液体 商品甲醛为37 40 甲醛水溶液 也即福尔马林 一般固定用配制的浓度为4 8 习惯上称为10 或20 的福尔马林 此液可按前述取材大小在常温下固定24小时 48小时 若需要快速固定 可加温到70 80 或者加温煮沸10分钟即可达到固定要求 这种快速固
11、定组织块不宜过厚或过大 缺点是组织收缩较严重 配法 将商品甲醛1份与9份自来水 最好用PBS等缓冲液配制 混合即为4 浓度的甲醛固定液 优点 渗透力较强 组织收缩小 细胞核染色较好 缺点 一般质量较差的Formalin在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物 称为三聚甲醛 即付醛 后者经氧化便成为甲酸而使溶液呈酸性 可影响细胞核的嗜硷性染色 纠正办法 可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙 碳酸镁或简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白粉笔作为中和剂 另外酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色素称福尔马林色素 在切片上见到的是黑色小颗粒 这种色素颗粒即不溶于水也不溶于酒精 影响染色效果和切片
12、的观察 除掉福尔马林色素颗粒的办法 Schridde氏法25 氨水lml75 酒精200ml切片脱蜡后经70 酒精时用上液浸泡半小时或稍长一些时间 然后水洗再行染色 Verocay氏法l 氢氧化钾lml70 酒精100ml切片脱蜡后经80 酒精时入上液处理10分钟 再经70 酒精入水 3 锇酸 四氧化锇 osmicacid 它并不是酸 实际上是一种金属氧化物 其水溶液呈中性反应 为淡黄色结晶 价昂贵 只适用于特殊染色中 如制作电镜超薄切片前的小组织块固定 锇酸为强氧化剂 不可与酒精及甲醛混用 锇酸极易挥发 气味有强烈的刺激性和固定作用 用时必须十分小心 要有防护措施 特点 它固定的组织必须小而
13、薄 其主要优点是能将组织固定与生活时期相仿 锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂 特别对显示线粒体及内质网等细胞器有良好的效果 配制 电镜超薄切片的小组织块后固定用锇酸浓度为1 0 2mol L磷酸缓冲液pH7 2 7 410ml 2 四氧化锇水溶液10ml 4 丙酮acetone丙酮能使蛋白质沉淀 其渗透力强但对组织收缩严重 对细胞核的固定欠佳 目前在组织化学中 特别是酶的保存方面多采用冷丙酮固定法 主要用于磷酸酶及氧化酶的固定 有时也用于混合固定液中 5 多聚甲醛缓冲固定液paraformaldehyde多聚甲醛4g 加入0 1mol L磷酸缓冲液pH7 2100ml中 加热60 80 溶解 固
14、定15min 24h 0 4 主要用于科研组织标本的固定 尤其用于免疫组织化学染色的组织固定 保护抗原决定簇不被封闭 6 戊二醛磷酸缓冲固定液glutaricdialdehyde25 戊二醛10ml 加入0 1mol L磷酸缓冲液pH7 2 7 490ml中 固定时间为60min 0 4 主要用于科研组织标本的固定 尤其用于电镜超薄切片的小组织块标本的初固定 常用混合固定液 种类很多 可根据检查目的不同选择不同的固定液 1 Zenker固定液 重铬酸钾2 5g升汞 氯化高汞 HgCl2 5g蒸馏水100ml冰醋酸 临用时加入 5ml 配制方法 首先将重铬酸钾 升汞和蒸馏水混合后加温溶解 冷却后
15、过滤 置于棕色玻璃瓶中避光保存 这种配制的液体一般称为Zenker氏干液 储存液 底液 此液较为稳定 即使配制1 2年后仍有固定作用 待组织取材时则在Zenker干液100ml中加入5ml冰醋酸即可使用 但加入冰醋酸后必须立即使用 否则失去固定作用 特点 对细胞核 胞浆染色均较清晰 也较稳定 对肌组织及结缔组织染色效果好 材料厚度不超过2mm固定3 4小时即可 一般固定为12 24小时 但必须经流水洗12 24小时后再经酒精脱水 2 Carnoy固定液纯酒精 或者95 6份氯仿3份冰醋酸1份优点 此液穿透速度快 小块组织l 2小时即可 此固定液可固定细胞浆及糖原 冰醋酸对染色质有固定作用 同时
16、能抵消由于酒精引起的过度收缩与硬化 为了减少组织的收缩 可采用冷Carnoy液 Carnoy液随组织一起放置冰箱中固定一般固定时间以不超过12 18小时为好 经此液固定的组织可直接入95 或者100 酒精脱水 现用现配为佳 它既可以用于一般组织学固定 可为组织化学常用固定剂 特别是用于糖原 DNA和RNA的固定 组织固定方法 1 原位固定法在动物活体情况下 采用快速边取材边滴加固定液 取出标本后再浸泡固定30min 1h 这样有益于组织结构的保存 以上操作应在0 4 下进行 2 浸透固定法预先冷藏固定液0 4 固定液量应是样品40倍以上 浸泡30 90min或更长 应根据组织和固定液的不同而定 3 培养细胞和涂片固定法单层细胞培养瓶只需将培养内盖片取出浸透固定即可 悬液培养细胞应离心浓缩后涂片 或离心管内加入固定液2000r min约20min离心成团后制作切片 也可以向离心管内加入胶冻再离心 切取离心管尖端胶冻固定 4 灌注固定法通过心血管途径将固定剂灌注到全身或某一器官 使生活的细胞在原位迅速固定后再取材 可达到非常好的固定效果 尤其对于脑等需要很长取材时间的器官更有意义 麻醉或颈
