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1、瘦肉精在猪尿中的浓度与组织残留消除的相关性研究瘦肉精在猪尿中的浓度与组织残留消除的相关性研究 摘 要： 15只健康猪(42.84.4kg)，随机分为3组，在饲料中添加5mg/kg盐酸克伦特罗，连续饲喂7天后，利用ELISA法监测猪只饲养过程中尿液和各种组织中盐酸克伦特罗，研究其残留的消除规律。试验结果表明：克伦特罗（瘦肉精）在猪体内各种组织有广泛的分布，在零休药期，按每g组织含克伦特罗的残留浓度，最高为肺和肝，分别达1497.7 ng/g和1428.2 ng/g，其他组织依次为肾脏 脾脏 心脏 肌肉，肌肉最低为98.1 ng/g，肺和肝的浓度约为肌肉的15倍；尿液和各种组织中盐酸克伦特罗的消除
2、呈正相关关系，通过监测猪尿中瘦肉精的含量就可以真实的反映生猪各种组织中的瘦肉精残留情况；同时表明，开展生猪的瘦肉精残留监测时，尿中检测阳性判定限定在12 ng/mL是安全可行的。关键词： 瘦肉精；猪；残留；消除规律；安全瘦肉精，学名克伦特罗(Clenbuterol，CL) ，商品名称为平喘素、克喘素，是一种人工合成的肾上腺素能受体激动剂，化学名称为1-4 氨基 3，5 二氯苯基-2-叔丁氨基乙醇盐酸盐1。80年代初发现受体激动剂可促进动物机体生长并改变机体胴体组成。资料显示，在许多动物的研究中均发现这类物质对机体的营养起着重分配作用，从而调节机体的生长发育，能使肌肉增重和体脂下降2。1990年
3、前在欧美畜牧业中曾应用作饲料添加剂，后因发现消费者食用含有此药残留物较多的肉品，导致多次集体中毒事件3，促使欧美国家明令禁止使用此药作为饲料添加剂饲喂家畜。在90年代中期，我国畜牧业生产特别是在生猪饲养中开始大量使用4，自1998年4月发生的香港“克伦特罗中毒事件”后，在我国发生多起集体中毒事件5,6,7,8。我国自1998年开始在全国范围内对非法生产、销售和使用盐酸克伦特罗等药品行为进行查处。农业部自1999年开始在全国部分地区进行生猪瘦肉精残留情况的监督抽查，取得了很大成效，但时至今日，部分地区的生猪瘦肉精残留问题仍然十分严重，威胁和危害着人民的身体健康。为了保障人民的健康，目前主要采用监
4、测尿中有无克伦特罗来判定生猪是否有瘦肉精残留。但组织中瘦肉精残留与尿中浓度的关系尚未见报道，为什么通过检测尿中克伦特罗的含量就能确定猪的各种组织中的含量？它们的关系是怎样的？这种检测方法能否确保猪肉产品的安全？带着这几个问题，我们设计了本试验，在猪饲料中添加盐酸克伦特罗，通过检测停止给药前后不同时间中尿液和各种可食性组织中克伦特罗的含量，建立在模拟生猪饲养环境下尿液中盐酸克伦特罗的消除规律和各食用组织中的药物残留的关系，从而证实监测猪尿中瘦肉精的含量就可以反映出猪体内各食用组织的残留情况，并推算出尿液中的最合适的判定限。1 材料与方法1.1 动物 15头健康的杜洛克、长白、约克夏杂交公猪（已去
5、势），体重42.84.4kg。按常规饲养，自由饮水，一天饲喂两顿，每顿给料量0.70.8kg/头，饲料为全价日粮，不含抗菌药物。临床观察两周表现健康。1.2 药品和试剂 盐酸克伦特罗原料药，含量99.9%。RIDASCREEN Clenbuterol FAST 克伦特罗Elisa检测试剂盒（Art NO.: R1701）及RIDA C18固相萃取小柱（Art NO.: R2002），德国R-Biopharma AG公司生产。1.3 给药和样品采集将盐酸克伦特罗按每kg饲料5mg的浓度添加，连续饲喂7d后停止给药。自给药后0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、2
6、7、29、31、33、35d采集尿样，分别于停止给药后0、19、27d将猪只屠宰，每次随机取5只，分别采集肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏组织。所有样品采集后1h内置-18下保存，待测。1.3 ELISA测定程序 使用前将试剂盒室温(2025)放置12 h。按每个标准溶液和样品做2个重复测定计算所需酶联板条的数量，插入框架。向微孔中加入100 mL用缓冲液稀释的抗体，用封口膜封好，室温孵育15 min。倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加水于酶联板的微孔内，倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复操作两次。精密吸取20mL标准溶液或样品至微孔中，并在每孔内
7、加入100mL用缓冲液稀释的酶结合物，在微型震荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30 min。倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加水到酶联板的微孔内，倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复操作两次。每孔加50 mL底物缓冲液和50 mL发色剂，在微型振荡器上充分混匀(也可先将底物和发色剂混匀，每孔加100 mL)，室温避光孵育15 min。每孔加100 mL终止液，混匀。于450 nm处测定吸光度值，60 min内完成读数。计算百分吸光度值，以标准溶液中克伦特罗浓度(ng/mL)的自然对数和百分吸光度值，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出供试样品中克伦特罗的
8、浓度(ng/mL)。本方法最低检测限为0.1ng/g，并在检测过程中部分样品用GC/MS方法进行了验证。1.5 尿样中盐酸克伦特罗浓度的测定 取20mL直接按照1.4进行测定。超出标准曲线的样品按照一定的比例用蒸馏水稀释后进行检测。1.6 肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏组织中盐酸克伦特罗浓度的测定 将组织样品匀浆，取5g样品与25mL 0.05mol/L HCl溶液混合，振荡均质1.5h，称取6g均质物（相当于1g组织）离心，取上清液，加入300mL 1 mol/L NaOH溶液混合15min，加入4mL 0.5 mol/L KH2PO4缓冲液(pH3.0)，简单混合，置4下过夜，离心，取
9、上清液在室温下用RIDA C18柱净化，收集甲醇洗脱液，在5060下用N2气流挥干溶剂，用0.4mL蒸馏水溶解残留物，取20mL按照1.4进行测定。超出标准曲线的样品按照一定的比例用蒸馏水稀释后进行检测。2 结果给药后尿中瘦肉精的浓度见表1及消除规律时间曲线见图1。零休药期尿及各种组织中瘦肉精的浓度见表2、图2。休药19d后尿及各种组织中瘦肉精的浓度见表3、图3。休药27d后尿及各种组织中瘦肉精的浓度见表4、图4。表1 ：连续7天通过饲料中添加5mg/kg瘦肉精后尿中药物浓度(ng/mL)时间猪 号SD(d)T01T04T05T06T15T02T03T09T12T14T07T08T10T11T
10、1300000000000000000121.120.422.219.117.720.222.518.222.222.518.219.820.119.217.820.11.7325.725.925.624.123.625.425.526.426.325.626.725.425.626.124.625.50.8539.440.540.939.239.842.540.639.641.942.540.940.941.141.341.140.81.0762.560.462.561.563.759.662.762.961.562.261.362.561.360.661.161.81.1952.549.4
11、49.250.649.651.950.651.149.252.250.61.31148.846.843.246.145.949.646.448.846.547.847.01.9（续上表）1340.145.439.742.640.943.942.144.244.345.842.92.21536.135.133.234.733.730.134.635.934.737.534.61.991726.12725.128.328.627.427.831.431.126.227.92.11920.221.819.617.420.416.420.416.514.315.818.32.5218.910.47.9
12、8.69.18.37.98.28.38.18.60.8232.45.13.22.92.63.42.72.53.12.63.10.8252.12.51.91.82.11.51.11.91.61.61.80.4271.41.810.90.81.20.42911.20.70.80.60.90.2310.60.90.30.60.40.60.2330.40.80.30.40.30.40.2350.10.50.20.30.10.20.2 图1 给药后尿中瘦肉精排泄浓度时间曲线表2 ： 零休药期尿及各种组织中瘦肉精的残留量（ng/mL(g)）样品名称猪 号SDT07T08T10T11T13尿61.362.561.360.661.161.40.7肌肉102.493.795.2105.393.998.15.4心脏97.396.6103.5108.992.699.86.4肝脏1451.91435.11302.71465.41485.71428.272.5脾脏452.2387.6341.6428.4426.2407.243.4肺脏1547.71561.71351.11575.71452.51497.795.2肾脏675.5787.8742.7598.5592.2679.386.5表3 ： 休药19d后尿及各种组织中瘦肉精的残留量(ng/mL(g)样品名称猪
