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1、一种治疗真菌病的基因工程药物赛内汀的研制病原微生物是危害人类健康的一大杀手，千百年来人类为此付出了巨大的代价。真菌病，尤其是浅部真菌病，在我国较为常见。近几年来，随着免疫抑制剂的广泛应用，烧伤抢救、放射治疗、器官移植的广泛进行，特别是免疫缺陷患者，尤其是艾滋病患者的不断增加，真菌病的发病率有逐渐增加的趋势。据报道艾滋病患者中约有1/3并发各种真菌病而致死。目前临床上应用的抗真菌药物主要有2大类，一类是化学制剂：包括染料类制剂，如龙胆紫、结晶紫；碘制剂，如碘化钾、聚维酮；脂肪酸类制剂，如十一烯酸、十一烯酥锌；咪唑类药物，如克霉唑、咪康唑；丙烯胺类制剂，如萘替芬、特比萘芬；以及其他化学制剂，如土槿
2、酸、氟胞嘧啶等。另一类是抗生素类药物：包括多烯类抗真菌抗生素，如制霉菌素、碘古霉素等；非多烯类抗真菌抗生素，如灰黄霉素、萨拉霉素。近几年来，也出现了一些新的抗真菌新药如阿莫芬类、两性霉素B脂质体、萨普康唑、-1,3葡聚糖合成酶抑制剂等等。这些抗真菌药物大都是通过破坏真菌的代谢途径或阻断大分子的生物合成来达到抗真菌效果，这样就容易使病原真菌产生抗药性；同时对宿主细胞也产生了一定的毒性。目前临床上对病原细菌的防治也仍然局限于抗生素类药物。抗生素类药物的使用对抑杀细菌起了极其重要的作用，但同时也造成了耐药性菌株的产生和人体的过敏反应。随着生物工程特别是基因工程技术的迅猛发展，蛋白质及多肽类药物不断问
3、世。蛋白质及多肽类药物是当今生物技术及制药工业中最为活跃的领域之一，已经显示出了巨大的社会效益和经济效益。美国FDA已批准的蛋白质及多肽类药物就有人胰岛素、人生长激素、干扰素（INF-、）、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）、促红细胞生成素（EPO）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、白细胞介素2（IL-2）等。利用基因工程手段，在宿主生物中表达生产重组蛋白及多肽，然后分离纯化表达产物，用于药物的研制及开发，已成为生物制药的重要组成部分。抗菌肽是生物体免疫诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000-7000D左右，由20-60个氨基酸残基组成。目前报道的抗菌肽类，大多对细菌具有广谱的抗
4、性。但对丝状病原真菌无明显的抑杀作用。令人欣喜的是，Pascale Fehlbaum等在E.coli诱导的 斑腹刺益蝽（Podisus.maculiventris）的血淋巴中分离了一种21aa的多肽Thanatin，研究发现，Thanatin对细菌和真菌都具有广谱抗性。它抑制的细菌包括革兰氏阳性菌：浅绿气杆菌(Aerococcus viridans),枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；革兰氏阴性菌：大肠杆菌（E.coli）,鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella trphimurium）,肺炎杆菌（Klebsiella p
5、neumoniae）；抑制的真菌有：粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）,灰色葡萄孢菌（Botrytis cinerea）,绿色木霉（Trichoderma viride）,黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）,烟曲霉（Aspergillus fumigatus）,从赤霉菌（Nectria haematococca），甘蓝链孢菌（Alteranria brasstcola），须发癣菌（Trechophyton mentagrophytes）等.致病真菌流行病学动态研究表明，最近几年来，须发癣菌一直保持着较高的发病率，占真菌病的1020，丝状病原真菌也具有较高的发病率，而
6、抗真菌肽Thanatin对须发癣菌和丝状病原真菌都具有较强的抑杀作用。本设计利用基因工程方法，构建了Thanatin 同向串联四拷贝基因，将其转化到酵母中表达，然后将分离纯化的活性成份研制成抗真菌的基因工程药物赛内汀（Thanatin的谐音）。同时对药物的活性、稳定性、代谢及安全性等进行检测与分析。目前，关于抗真菌的多肽及蛋白质药物，研究较少，还未见相应的产品投放市场，希望本研究能在此领域填补国内空白，开发出我国具用自主知识产权的基因工程药物，用于临床真菌病及细菌病的防治。第一章 Thanatin 同向串联四拷贝基因的构建小分子多肽在基因工程表达中，存在着表达量低，表达产物易降解，检测和纯化困
7、难等缺点。多拷贝基因融合表达，将会大大克服上述缺点，既能增加表达量，又能使表达产物不易被降解，同时又便于检测及表达产物的纯化。但并非外源基因拷贝数越多越好，高水平的表达还会阻碍产物的分泌。对此，本设计构建了Thanatin 同向串联四拷贝基因，进行融合表达，以期提高分泌表达水平。根据毕赤酵母喜好的高表达优越密码子，设计了Thanatin基因两条链的碱基序列，在其5端分别加上了多肽切割中溴化氰识别的蛋氨酸密码子（ATG/TAC）,作为粘性末端。同时设计了含有EcoRI和XhoI酶切位点的接头，既用于串联四拷贝基因的连接，又方便以后的克隆和表达。1 方法11基因片断及接头的设计基因片断1：5ATG
8、GGTTCCAAGAAGCCAGTTCCAATCATCTACTGTAACAGAAGAACTGGTAAGTGTCAAAGAATG3基因片断25CATCATTCTTTGACACTTACCAGTTCTTCTGTTACAGTAGATGATTGGAACTGGCTTCTTGGAACC3接头a:5CGC GAATTC3（含EcoRI酶切位点）接头a:5CATGAATTCGCG3接头b:5ATGCTCGAGTGC（含XhoI酶切位点）接头b:5GCAGAGCTC31.2基因及接头的磷酸化将基因片断1、基因片断2；接头a、接头b分别按T4噬菌体多核苷酸激酶（T4PNK）说明书进行磷酸化。13基因及接头的复性将基
9、因片断1和基因片断2；接头a、接头a ；接头b、接头b分别等摩尔混合，置于85水浴1分钟，然后关闭电源，随水温降低至室温。14基因与接头的连接将25pmol Thanatin基因和60pmol EcoRI前接头、25pmol Thanatin基因和60pmolXhoI后接头分别置于15的PEG8000的连接体系中连接12hr,然后每隔6hr向管中添加40pmol Thanatin基因;每隔12hr补加连接酶及ATP,在PAGE检测连接产物大小合适后，将两管混合，并补加连接酶及ATP继续连接12hr。15连接产物的回收将连接产物在2的琼脂糖凝胶上电泳，按凝胶回收试剂盒QIAquick Gel E
10、xtraction Kit说明书的方法回收约290bp的片断。第二章Thanatin 同向串联四拷贝基因在酵母中的表达外源基因表达系统的应用已经较为成熟，如微生物表达系统、动物细胞表达系统、动物乳腺生物反应器及转基因动植物表达系统等等。其中，微生物表达系统最为成熟。本设计即采用甲醇营养型毕赤酵母表达系统。酵母是一种单细胞真核生物，它的细胞结构和代谢机制与高等真核细胞较为相似。它可以对蛋白进行多种翻译后修饰如糖基化等，这是大肠杆菌表达系统所不具备的。酵母菌生长迅速，适于大量培养，安全性高，经济成本低。本设计使用的甲醇营养型酵母表达系统还具有如下显著的优点：.高表达。该表达载体利用了AOX(甲醇氧
11、化酶基因)启动子，用甲醇可以调控表达，所以表达水平很高。例如破伤风毒素C的表达量可达12g/L,是用其他表达系统表达量的10倍甚至100倍。.高稳定。外源基因易于整合到酵母染色体上，可稳定遗传。同时胞内存在过氧化物酶体，表达产物可进入其中，从而免受蛋白酶降解或使宿主细胞免受外源蛋白毒害。.高分泌。因其含有一个较强的分泌信号序列因子前导序列，所以具有较好的分泌效果。.高培养。该表达系统可实现高密度培养，细胞干重可达100g/L。1 技术路线thanatins pPICZ-AEcoRIXhoI EcoRIXhoIT4DNA ligase连接pPICZ-Ath转化E.coLi Top10酶切鉴定 P
12、CR鉴定测序鉴定重组质粒转化酵母受体菌GS115鉴定 活性检测及分离纯化2 方法2.1. 连接产物的酶切用EcoRI和XhoI对上述得到的连接产物进行双酶切,然后按常规方法纯化酶切产物。22.重组表达载体pPICZ-Ath的构建用EcoRI和XhoI对质粒pPICZ-A双酶切，然后与2.1中酶切产物连接。16过夜。23E.coLi Top10感受态细胞的制备及重组质粒转化 巴斯德毕赤酵母表达系统质粒载体含有特殊的抗生素（Zerocin）筛选标记，Zerocin的抗性检测需要在特定的E.coLi Top10受体菌中进行。E.coLi Top10感受态细胞的制备及重组质粒转化参照分子克隆实验指南(
13、第二版)方法进行。24重组子的筛选及鉴定241重组子的筛选根据-互补，蓝白斑筛选可能的阳性重组子。242重组子的PCR鉴定根据1.1中Thanatin基因的序列设计引物，上游引物P1：5 GGTTCCAAGAAGCCAGTTCCA3下游引物P2：5 CATTCTTTGACACTTACCAGT3。 PCR反应体系：重组质粒：1uL；dNTP(2mol/L)：2uL；buffer： 2uL；MgCl2(25mmol/L)：1.5uL；P1(5uM)：1uL ；P2(5uM)：1uL；TaqDNA聚合酶（1U/uL）：1uL;ddH2O：10.5 uL。PCR反应条件：95 ,3min ；94 1m
14、in；55 ，1min；72 1min共30个循环；72 ,10min延伸。2.43重组质粒的酶切鉴定用EcoRI和XhoI对重组质粒进行双酶切，电泳检测是否能切下290bp的片段。2.4.4测序鉴定 PCR鉴定和酶切鉴定后的重组质粒测序，检查Thanatin 同向串联四拷贝基因序列合成是否正确无误。鉴定正确无误后，方可进行下面的实验。25Thanatin 同向串联四拷贝基因转化酵母251酵母感受态细胞的制备 接种酵母菌GS115单菌落于3mLYEPD培养基中，30，200rpm振荡培养过夜，取1mL菌液转接到50mLYEPD培养基中，30，200rpm振荡培养约6h，至OD600=0.8-1
15、.0,然后1500rpm 离心10min,收集酵母细胞，先用灭菌水洗涤1次，然后离心去上清，菌体重新悬浮于1mL 0.1moL/L的LiCl中，10000rpm离心15sec,沉淀悬浮于400uL1moL/L的LiCl中，即可用于转化实验。252重组表达载体pPICZ-Ath的线性化及变性 为提高转化效率，用SacI酶切，使重组质粒pPICZ-Ath线性化，然后 100加热5min,迅速冰浴，使其变性，即可进行下一步转化工作。253重组表达载体pPICZ-Ath转化酵母取上述制备的酵母GS115感受态细胞50uL,1500rpm离心10min,弃上清，依次加入：240uL50PEG-4000, 36uL0.1moL/L的LiCl,25uL(2mg/mL)变性过的单链DNA,充分混匀，30静置30min,42热击25min,冷却至室温后1500rpm离心10min,沉淀悬浮于500uLYEPD培养基中，然后取200uL涂布YEPD平板（含100ug/mLZerocin）, 30培养24天。26重组转化酵母的
