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1、 Genistein后处理介导大鼠海马CA1区eNOS Nrf2 HO 1信号通路及其神经保护作用 来源 赛恩斯http 一 研究的背景及意义 1 对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关注的重点 2 缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首要措施 然而 大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组织的损伤 即缺血再灌注损伤 3 氧化应激和炎症是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要组成部分 脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生 并迅速启动损伤级联 加剧了初始损害最终导致神经元不可逆的损伤 因此 再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性神经元死亡的关键 那么 Genisteinpostc
2、onditioning GPC 即缺血后给予Genistein 是否能通过eNOS Nrf2 ARE信号通路降低氧化应激 从而发挥抗缺血性神经元损伤的作用 目前尚未见报道 本研究采用四动脉结扎 4 VO 全脑缺血模型 观察GPC对缺血性神经元的保护作用 并探讨其可能的分子机制 为临床防治缺血性脑中风提供理论依据 二 材料与方法 1 主要实验仪器和试剂 大鼠脑立体定位仪大鼠脑微量注射泵冰冻切片机激光扫描共聚焦显微镜酶标仪电泳设备摇床Morris水迷宫超低温冰箱等 组织裂解液BCA蛋白浓度测定试剂盒eNOS p eNOS Nrf2 HO 1一抗及其相应的二抗NBT BCIP显色液NeuN 4 HN
3、E 8 OHdG一抗及对应的荧光二抗TUNEL试剂盒 2 实验分组 SPF级成年雄性SD大鼠 随机分组及4 VO模型 3 技术路线图 再灌注5d检测海马CA1区神经元的凋亡及存活 实验方法及检测指标 再灌注30min 6h 1d 3d观察p eNOS Nrf2 HO 1蛋白表达 免疫荧光染色法 蛋白免疫印迹技术 TUNEL染色及NeuN染色 再灌注3d观察海马CA1区神经元8 OHdG 4 HNE Nrf2 HO 1蛋白的表达及定位 Morris水迷宫 再灌注7 9d 检测大鼠的空间学习和记忆能力 4 统计学分析 数据整理后 应用SigmaStat3 5统计软件进行统计学分析 所有计量资料数值
4、以均数 标准差表示 采用单因素方差分析 ANOVA 多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法 LSD 各实验组之间比较采用q检验 Newman keulstest P 0 05为差异有统计学意义 三 实验结果与讨论 图1NeuN及TUNEL免疫荧光染色观察再灌注5d大鼠海马CA1区神经元的存活及凋亡 图A NeuN 红色 染色 生存的神经元 TUNEL 绿色 染色 凋亡样神经元 图B 海马CA1区1mm长度内NeuN阳性神经元数量统计图 图C 海马CA1区1mm长度内TUNEL阳性神经元数量统计图 P 0 05vs I R组 P 0 05vs GPC组 n 5 40 bar 50 m 小结1G
5、enistein后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用 eNOS激酶抑制剂L NAME减弱了该作用 说明eNOS可能参与了此保护作用 图2GPC对大鼠海马CA1区神经元eNOS p eNOS蛋白表达的影响 图A 再灌注不同时间点p eNOS eNOS蛋白的表达 Sh Sham组 R 再灌注 I R组 GPC组 GPC Genistein后处理 图B p eNOS蛋白表达统计图 n 4 p 0 05vs I R组 A B 图3L NAME对再灌注3d大鼠海马CA1区神经元eNOS磷酸化水平的影响 图A 各实验组再灌注3dp eNOS蛋白表达 图B 各实验组再灌注3dp eNOS蛋白表达统计图 n
6、5 p 0 05VS I R组 p 0 05VS Vehicle2组 小结2Genistein后处理可诱导全脑缺血大鼠海马CA1区eNOS磷酸化水平升高 eNOS激酶抑制剂L NAME可有效降低GPC诱导的eNOS磷酸化水平 结果揭示 eNOS磷酸化水平升高参与了Genistein的神经保护作用 图4全脑缺血再灌注3d 各实验组大鼠海马CA1区4 HNE及8 OHdG免疫荧光染色 A 图A 绿色 NeuN 红色 4 HNE 图B 红色 DAPI 绿色 8 OHdG n 4 5 40 bar 50 m 小结3GPC能有效降低氧化应激损伤 eNOS激酶抑制剂L NAME废除了此神经保护作用 图5A
7、 CGPC促进大鼠海马CA1区Nrf2蛋白表达 图A 再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达 图B 再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达统计图 n 4 p 0 05vs I R组 图C 再灌注3d各实验组Nrf2蛋白的表达及统计图 p 0 001vs I R组 p 0 001vs Vehicle2组 A C B 图5D免疫荧光染色法观察大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内Nrf2的表达及定位 绿色 Nrf2 红色 NeuN 黄色 二者的共定位 40 bar 30 m L NAME 图6大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内HO 1蛋白表达及其与Nrf2的共定位 B 图A B HO 1蛋白表达及其统计图
8、 图C HO 1与Nrf2蛋白的共定位 p 0 05VS I R组 p 0 05VS vehicle2组 绿色 Nrf2 红色 HO 1 蓝色 DAPI 合成图为三者的共定位 40 n 4 5 bar 50 m 小结4GPC可显著增加海马CA1区神经元胞核中Nrf2蛋白的表达并引起下游靶基因HO 1的表达 而L NAME阻断了此作用 此结果进一步揭示GPC通过eNOS诱导了Nrf2 HO 1抗氧化信号通路 从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤 图7GPC对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响 图A B 潜伏实验和探索实验统计图 n 5 p 0 05vs I R组 p 0 05vs GPC组 图C D 潜伏实验和探索实验大鼠游泳路程轨迹图 D C A B 小结5GPC能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力 四 总结 1 GPC对缺血性神经元损伤具有保护作用 2 GPC可通过诱导eNOS磷酸化水平并上调Nrf2 HO 1信号通路 从而降低脑缺血诱导的氧化应激损伤 3 GPC能有效改善大鼠短暂全脑缺血后的认知功能 五 不足与展望 1 GPC是否可增加Nrf2的DNA结合活性有待进一步研究 2 GPC是否也触发了其它促生存信号转导通路 如雌激素受体信号 从而起到抗缺血性神经元损伤的作用 其确切的机制还有待多层面 多角度的进一步探究 谢谢
