发育生物学的新领域 干细胞

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1、第十九章干细胞 发育生物学的新领域 1 2 近年来在干细胞理论和技术研究方面取得了长足的进展 1999年12月 美国 科学 杂志把干细胞生物学和以干细胞临床应用为内容的干细胞生物工程评为20世纪世界科学进展的最重要领域 已经成为继人类基因组大规模测序之后最具活力 最有影响和最有应用前景的生命科学研究领域之一 内容 第一节干细胞生物学第二节干细胞工程原理与技术 3 第一节干细胞生物学 干细胞的定义和生物学特点干细胞的分类干细胞自我更新与分化的调控 4 干细胞的定义 干细胞 StemCells 是一群未分化的 具有自我更新 self renewal 能力和多向分化潜能 potency 的细胞 它既

2、能产生表型与基因型完全相同的子代细胞 也能产生组成机体各组织和器官的高度分化的细胞 5 干细胞的起源和进展 1896E BWilson首次用这个名词描述寄生虫生殖系的祖细胞1963Till和McCulloch发现小鼠骨髓中存在能够自我更新的细胞1968骨髓移植治疗重症联合免疫缺陷综合症 SCID 获得成功1978在人类的脐带血中发现存在造血干细胞1981Evans和Kaufman建立小鼠胚胎干细胞系1997白血病起源于造血干细胞的发现证实了肿瘤干细胞的存在1998Thomson等建立第一个人胚胎干细胞系1996克隆羊Dolly诞生2000s很多报道表明成体干细胞具有可塑性2001美国Advan

3、cedCellTechnology公司的科学家首次采用克隆技术培育出人类早期胚胎 6个分裂球 2004 2005韩国研究者黄禹锡 HwangWoo suk 声称利用体细胞核转移技术培育出几种人类胚胎干细胞系 后来被证实是伪造的2006英国科学家用脐带血干细胞分化出第一个人造肝细胞 6 干细胞的起源和进展 2007 1科学家发现在羊水中存在一种新型干细胞 它可以在研究与治疗中替代胚胎干细胞2007 63个研究小组同时报道发现小鼠正常的皮肤细胞可以重新编程成为干细胞 同时科学家ShoukhratMitalipov首次报道通过体细胞核转移技术制备猴胚胎干细胞成功2007 10MarioCapecch

4、i MartinEvans和OliverSmithies分获诺贝尔生理和医学奖 奖励他们在胚胎干细胞和小鼠基因 敲除 方面的贡献2007 11日本科学家宣布成功把人体皮肤细胞 纤维原细胞 改造成类似胚胎干细胞的多潜能干细胞 诱导性多潜能干细胞2008 1不需要破坏胚胎即可制备人类胚胎干细胞系 AdvancedCellTechnology 2008 1美国科学家利用人的成纤维细胞核进行体细胞核转移技术获得了人类的胚泡 囊胚 2008 3自体间充质干细胞成功治疗关节变性病2008 10德国科学家成功把人类睾丸细胞改造成多潜能干细胞 美国科学家将人类发根的角化细胞转化为类胚胎干细胞 7 干细胞的生物

5、学特点 属低分化细胞 缺乏分化标记 在机体的数目和位置相对恒定 具有自我更新能力 具有多向分化潜能 即具有分化发育的可塑性 其分化受所处周围微环境 niche 的影响 能无限地分裂 增殖 分裂的慢周期性 绝大多数干细胞处于G0期 两种生长方式 一是对称分裂 形成两个相同的干细胞 二是不对称分裂 一个子代细胞保持干细胞特性 另一个成为祖细胞 最终分化成终末细胞 8 干细胞的生长分裂方式 9 干细胞的分类 根据发生学来源分类胚胎干细胞 Embryonicstemcells ESCs 是指由胚胎内细胞团 innercellmass ICM 经体外抑制培养 在传代过程中筛选出的具有多能性的细胞 成体干

6、细胞 Adultstemcells 是指存在于一种已经分化组织的未分化细胞 这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞 例如 造血干细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 肝干细胞 皮肤表皮干细胞 胰腺干细胞等 10 人类胚泡的形成 11 原肠胚期发育成3个胚层 外胚层 中胚层和内胚层 外胚层发育成神经系统 皮肤 指甲 鼻 口 肛门 眼球晶状体和视网膜 中胚层发育成身体的排泄系统 循环系统和运动系统 内胚层发育成内消化道 呼吸道等 人类组织分化 12 13 14 胚胎干细胞又称全能干细胞它是从胚胎细胞团中分离出来 能在体外培养的一种高度未分化细胞 是一种具有全能性或多向性分化潜能的细

7、胞 其特点是能大量繁殖并保持未分化状态 在一定条件下能向内 中 外3个胚层组织和细胞分化 易于进行基因改造操作 注入囊胚后能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育 形成嵌合体 在体外培养扩增时 经遗传操作 选择和冻存 均不失其全能性 在不同生长条件下具有不同的功能状态 成体干细胞横向分化的普遍性 预测并阐明横向分化机制 就有可能利用病人自身健康组织的干细胞诱导分化成病损组织的功能来治疗疾病 这样既可解决免疫排斥问题 又可避免胚胎细胞来源不足和社会伦理问题 目前研究的成体干细胞主要有造血干细胞 角膜缘干细胞 神经干细胞 皮肤干细胞 脂肪干细胞和胰腺干细胞等 16 根据分化潜能分类全能干细胞 Tot

8、ipotentstemcell 多潜能干细胞 Pluripotentstemcell 多能干细胞 Multipotentstemcells 单能干细胞 Unipotentstemcell 17 全能 Totipotent 干细胞 是指具有无限分化潜能 能分化成所有组织和器官的干细胞 包括胎盘 其具有发育成完整个体的能力 Totipotentcellshavethepotentialtobecomeanytypeintheadultbodyanycelloftheextraembryonicmembranes e g placenta 18 多潜能 Pluripotent 干细胞 是具有自我更新

9、能力和高度增殖以及多向分化潜能 并可以定向诱导分化为三个胚层中所有种类的细胞 它可以用来形成复杂的组织和器官 但与全能干细胞相比 它失去了发育成完整个体的能力 发育潜能受到一定限制 自然状态下存在的三种多潜能干细胞 胚胎干细胞 Embryonicstemcells ES 来源于体外受精的胚泡的内细胞团 胚胎生殖细胞 Embryonicgermcells EG 来自胎儿性腺的原生殖细胞 胚胎肿瘤细胞 EmbryonicCarcinomaCells EC 来自畸胎瘤 但为非整倍体细胞 19 胚胎生殖细胞 Embryonicgermcells EG 指来自于5 10周龄的胚胎性腺区的早期生殖细胞 在

10、发育后期 性腺区发育成睾丸或卵巢 原始生殖细胞 primordialgermcell PGC 产生精子或卵子 胚胎肿瘤细胞 EmbryonicCarcinomaCells EC 是来源于恶性畸胎瘤的一种多潜能干细胞 畸胎瘤是由机体内幼稚生殖细胞发生变异而形成的肿瘤 恶性畸胎瘤内既含有各种各样分化成熟的组织 还含有一些未分化的 能不断增殖的干细胞 因其形态和发育潜能都类似胚胎细胞 而且是恶性的 故称其为胚胎肿瘤细胞 20 Humanpluripotentembryonicstem ES andembryonicgerm EG cells 21 EScell 胚胎干细胞EGcell 胚胎生殖细胞E

11、Ccell 胚胎肿瘤细胞SSEA 阶段特异性胚胎抗原 TRA 抑制肿瘤抗原 1LIF 白血病抑制因子bFGF 碱性成纤维细胞生长因子EB 胚体 22 人工方法获得多潜能干细胞 体细胞核移殖技术 Somaticcellnucleartransfer SCNT 人工诱导的多潜能干细胞 Inducedpluripotentstemcell iPS 23 多能 Multipotent 干细胞 是指能分化成与其来源相近的特定组织或器官的干细胞 例如造血干细胞可以分化为红血细胞 白血细胞和血小板 肝干细胞能够分化为成熟的肝细胞 胆管上皮细胞 神经干细胞能够分化为神经元 神经胶质细胞等 24 BloodCe

12、llDifferentiationfromHematopoieticStemCells HSCs 25 单能 Unipotent 干细胞 只能产生一种细胞类型 但是 具有自我更新属性 将其与非干细胞区分开 如肝干细胞 胰腺干细胞 肠上皮干细胞 角膜缘干细胞等 受损的小鼠肝脏内 在肝胆管周围存在FoxL1表达阳性 水蓝色 的肝干细胞 它们被肝纤维细胞 品蓝 所包裹 构成了干细胞生存和发挥功能的微环境 26 干细胞自我更新与分化的调控 内源性调控细胞内多级水平的分子调控外源性调控 干细胞微环境 细胞因子细胞间的相互作用细胞外基质环境的理化性质 27 Wnt信号通路TGF 转化生长因子 bFGF碱性

13、成纤维细胞生长因子BMP骨形成蛋白S1P鞘氨醇 1 磷酸PDGF血小板来源的生长因子BDNF脑源性神经营养因子 内容 第一节干细胞生物学第二节干细胞工程原理与技术 28 第二节干细胞工程原理与技术 干细胞的来源干细胞的分离和培养干细胞定向诱导分化干细胞检测方法 29 干细胞工程 细胞治疗 cytotherapy 是应用具有特定功能的细胞群或细胞克隆治疗肿瘤 感染 自身免疫性疾病 基因缺陷等疾病的一种涉及生物免疫学和基因学的治疗手段 第一代细胞治疗 全血输注 第二代细胞治疗 骨髓和外周血干细胞移植 第三代细胞治疗 在分离纯化少量干细胞基础上 通过细胞工程技术 在体外扩增和定向诱导分化 或对其进行

14、基因改造后 将产生大量的目的细胞回输体内进行治疗 干细胞工程 是利用干细胞的增殖特性 多向分化潜能及其增殖分化的高度有序性 通过体外培养干细胞 诱导干细胞定向分化 或用转基因技术处理干细胞以改变其特性 以达到利用干细胞为人类服务的目的 30 干细胞的来源 干细胞的来源 胚胎 体外受精 核移殖技术 胎儿与新生儿脐带血 成体 31 干细胞的分离纯化 解离 散 组织制备细胞悬液 机械分离 酶学解离或免疫疗法 immunosurgery 人类胚胎干细胞的分离 32 干细胞的分离纯化 利用细胞体积和密度不同分离纯化利用细胞对不同基质的粘附性不同分离细胞 ArteriosclerThrombVascBio

15、l 2008 28 9 1584 95 33 干细胞的分离纯化 利用细胞表面标志分离纯化细胞表面标志 cellsurfacemarker 存在于某种细胞表面的特异性的表面蛋白 利用这些表面蛋白的特异性表达 应用抗体结合或其他的方法可以检测或获得相应的细胞 流式细胞分选术免疫磁珠分选术 IdentifyingCellSurfaceMarkersUsingFluorescentTags MicroscopicImageofFluorescent LabeledStemCell 34 未分化造血干细胞表面标记 35 流式细胞术Fluorescenceactivatedcellsorting FACS

16、 36 CD34 StemCells 健康人外周血CD34 细胞绝对值 1 06 0 51 107 LCD34 细胞占白细胞总数的 0 16 0 05 粒细胞 淋巴细胞单核细胞 37 免疫磁珠细胞分选 MACS 38 干细胞体外培养 胚胎干细胞体外培养的条件 质量良好的囊胚有效的内细胞团分离可靠稳定的培养系统有效稳定的传代 39 Directeddifferentiationofmouseembryonicstemcells 干细胞定向诱导分化 干细胞自发分化干细胞定向诱导分化 40 胚体 embryoidbody EB 在体外培养环境中 如果在胚胎干细胞的培养体系中撤除抑制细胞分化的因子 如饲养细胞或白血病抑制因子LIF等 胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力 可以自发形成多细胞结构 即胚体 胚体中含有3个胚层的细胞 胚体继续分化 可以自发分化为血细胞 内皮细胞及神经细胞等不同类型的细胞 体外培养 明胶基质 的小鼠胚胎干细胞形成的胚体 200 Biochemistry Mosc 2008 73 13 1438 52 干细胞自发分化 41 人类胚胎干细胞的自发分化 A 当人类胚胎干细