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1、鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因克隆和序列分析公文易文秘资源网佚名2008-10-14 0:33:41我要投稿 添加到百度搜藏提取的RNA纯度很高. H1,H4,H5,H7上游引物与下游引物IgG1扩增出800 bp左右片段；H3扩增出400 bp左右片段；H2,H6未见片段扩出（图1）. 下游引物IgG2b，IgG3与所有上游引物配对均未见片段扩出. 测序报告证实H1，H4，H5，H7引物扩增的重链Fd段基因具有同源性. 图2, 3为轻链PCR扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明L13引物扩增出700 bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.M：DL2000 marker
2、;1717对上游引物扩增的重链PCR产物.图1 重链Fd琼脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;1515对上游引物扩增的重链PCR产物.图2 15对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）2.2 转化感受态细菌 选取H1和L13的PCR产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为11，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落.23 菌落PCR电泳 可见重链800 bp左右的片段，可见轻链700 bp左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入T载体中. 用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至TaKaRa公司测序.2.4 重组质粒的插
3、入片段测序报告7-9 GenBank 登录号分别为AY484430，AY484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸（Cys）. 上述获得的抗体Fab段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人cTnI 单抗基因, 为IgG1亚型. 网上核对V BASE数据库，重链可变区属于VH3家族，J段来源于JH3a，轻链可变区属于VK亚类（Subgroup），J段来源于JK2.M：DL2000 marker；18613对上游引物扩增的轻链PCR产物.图3 613对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）M：DL2000 marker;1，6，8，9：未插入重链Fd段的PCR产物；25，7：插入重链F
4、d段的PCR产物.图4 重链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;14，613，15，16：插入轻链片段的PCR产物；5，14：未插入轻链片段的PCR产物.图5 轻链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略）3 讨论由于本实验室已有能分泌mAb cTnI的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用RTPCR技术，将抗cTnI抗体的Fab段基因扩增出来，测序，经Internet网(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)7核实，发现H1，H5，H7 3种引物扩增出来的重链序列具有同源性，为同一序列；在轻链基因克隆中，获得一个无功能的轻链产物
5、，它来自杂交瘤亲代细胞之一骨髓瘤细胞SP2/0. 有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道，最突出的特点是其轻链基因的第23位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸（Cys）. 如L25，L610等上游引物扩增出来的cDNA片段，均为这种无功能的轻链产物. L1，L11, L12等上游引物扩增出来的cDNA片段测序，经核实证明，缺失FR1和CDR1功能区. 唯有L13上游引物扩增出来的700 bp的cDNA片段为有功能的轻链基因产物. 为得到完整的Fab段基因序列，取H1和L13引物PCR产物做TA克隆. 测序结果用BLAST和DNAman软件分析，得到氨基酸序列的
6、编码框，中间都没有中止密码. 目前国内外尚未见抗cTnI抗体基因序列相关报道. 在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为AY484430，AY484431. 抗人cTnI抗体的Fab段基因的克隆及序列分析为抗人cTnI嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】1 张寄南，杨国平，苏恩本, 等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究J，中华心血管病杂志，1997, 25(5), 379-382.2 张寄南，苏恩本，魏 瑾, 等.血清肌钙蛋白I升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨J，中华心血管病杂志，1999, 27(6), 421-424
7、.3 Nageh T, Sherwood RA, Harris BM, et al. Cardiac troponin I for risk stratification following percutaneous coronary artery intervention in acute coronary syndromesJ. Catheter Cardiovasc Interv, 2001, 55(1), 37-42.4 mith SC Jr, Blair SN, Bonow RO, et al. AHA/ACC Guidelines for Preventing Heart Atta
8、ck and Death in Patients With Atherosclerotic Cardiovascular DiseaseAK GTG CAG CTC GAG SAG TCA GGA CCT3；H2: 5GAG GTY CAG CTC GAA CAR TCT GGA CCT3；H3: 5CAG GTC CAA CTC GAG CAG YCT GGG KCT3；H4: 5GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGR GCWG3；H5: 5GAR GTG AAG CTC GAA GAG WCT GGA SGA3；H6: 5GAG GTG AAG CTT CTC GA
9、C TCT GGA GGT3；H7: 5GAA GTG MAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA3；轻链基因的5端引物1：5CCT CTA GAG ACA TCC AGA TGA MCC AGT CTC C3；2：5CCT CTA GAG ACA TYK TGC TGA CYC ART CTC C3；3：5CCT CTA GAR ACA TTG TRA TGA CMC ART CTC C3；4：5CCT CTA GAG ACA TYC AGM TGA CYC AGT CTC C3；5：5CCT CTA GAG GAG ACA TTG TGA TGA CCC AGT C3；6：5C
10、CT CTA GAG ATA TTG TGM TAA CYC AGK MTS MAS YC3；7：5CCT CTA GAG ATA TCS WKA TGA CMC AGW CTM C3；8：5CCT CTA GAG CTG TTG TGR TGA CYC AAA CTC C3；9：5CCT CTA GAG ATG TTK TGA TGA CCC AMA CTC C3；10：5CCT CTA GAG ATG TTT TGA TGA MCC AAA YTC C3；11：5CCT CTA GAG ARA ATS TGC TCA CCC AGT CTC C3；12：5CCT CTA GAS AAA T
11、TG TTC TCA CCC AGT CTC C3；13：5CCT CTA GAC AGG CTG TTG TGA CTC AGG AAT C3;重链Fd段3端引物 IgG1：5AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT3;IgG2b：5CTC CTTACTAGTAGGACAGGGGTTGATTGT3;IgG3：5GGG GGT ACT AGT CTT GGG TAT TCT AGG CTC3;轻链基因3端引物： 5GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA3. 以上S=C/G，Y=C/T，M=A/C，W=A/T
12、，K=T/G，r=A/G，由TaKaRa公司合成.122 细胞总RNA提取 从生长良好、能分泌mAb cTnI的杂交瘤细胞中，用异硫氰酸胍法从5107杂交瘤细胞中提取总RNA.123 RTPCR扩增及其产物克隆 以Oligo dT9为引物逆转录合成cDNA. 以合成的cDNA为模板，用上述上下游引物分别两两配对，进行PCR，扩增出Fab段的重、轻链基因片段. 重链Fd段PCR反应条件为：94变性45 s，57退火45 s，72延伸60 s，35个循环，最后72延伸5 min；轻链反应条件为：94预变性10 min, 94变性1 min，60退火1 min，72延伸1 min，35个循环，最后7
13、2延伸10 min. 回收扩增的Fd和轻链基因，分别插入pMD18T载体中，取T载体0.5 L，回收的Fd或轻链基因4.5 L，Ligation Solution 15 L，总反应体积10 L，16过夜反应. 取4 L连接反应液转化E.coli DH5菌6. 利用蓝、白斑筛选，菌落PCR鉴定重组质粒.124 菌落PCR鉴定目的基因片段插入 引物序列为T载体的测序引物：上游引物（Sequencing Primer RVM）：5GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG3，下游引物（Sequencing Primer M1347）：5CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA C
14、GAC3，PCR反应条件为：94预变性10 min，94变性1 min, 52退火2 min，72 延伸2 min，30个循环，最后72延伸10 min. 取10 L的反应体积以13 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物. 电泳照片经计算机图像分析软件Quantity One处理.125 DNA序列测定与分析 将DNA样品及抽提的重组质粒送大连宝生物制品有限公司，经AB1310全自动测序仪进行序列测定. 用DNAMAN和BLAST软件分析所测序列.2 结果21 RNA提取和RTPCR扩增的目的基因片段及测序 从分泌mAb cTnI抗体的杂交瘤细胞系JS200202中提取总RNA，紫外分光光度计A
15、260 nm/A280 nm1.9, 说明提取的RNA纯度很高. H1,H4,H5,H7上游引物与下游引物IgG1扩增出800 bp左右片段；H3扩增出400 bp左右片段；H2,H6未见片段扩出（图1）. 下游引物IgG2b，IgG3与所有上游引物配对均未见片段扩出. 测序报告证实H1，H4，H5，H7引物扩增的重链Fd段基因具有同源性. 图2, 3为轻链PCR扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明L13引物扩增出700 bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段.M：DL2000 marker;1717对上游引物扩增的重链PCR产物.图1 重链Fd琼脂糖凝胶电泳（略）M：DL2000 marker;1515对上游引物扩增的重链PCR产物.图2 15对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略）2.2 转化感受态细菌 选取H1和L13的PCR产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为11，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落.2
