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1、1陕西汉族人群 ER 基因扩增片段酶切长度多态性作者：李军林， 舒青，郑强荪，冯蕾 【关键词】 ,雌激素受体基因 【Abstract 】 AIM: To study the distribution of ER intron 1 polymorphism in Han population of different ages and sexes in Shaanxi Province. METHODS: AmplificationRestriction Fragment length Polymorphism (AmpRFLP) was used to analyze the polymorp
2、hism of Han population in Shaanxi Province. The templates of PCR were extracted from 162 independent cases of different ages and sexes in Shaanxi Province. RESULTS: The full length of ER intron I after PCR was 1.3 kb. Using restriction endonuclease enzymes, three types of genotypes were obtained: Pv
3、u II: P/P (1.3 kb), P/p (1.3 kb, 850 and 450 bp) and p/p (850 bp, 450 bp). Using restriction endonuclease enzymes, another three types of genotypes were obtained: Xba I : X/X (1.3 kb), X/x （1.3 kb, 910 and 390 bp）and x/x（910 bp, 390 bp）. CONCLUSION: It is suggested that ER gene intron 1 of Han popul
4、ation in Shaanxi Province is polymorphism. The distribution of the genotype is not related 2to different age groups and different gender groups. 【Keywords】 ER gene；gene polymorphism；Han population in Shaanxi province 【摘要】 目的: 分析陕西省不同年龄和不同性别的汉族人群雌激素受体(ER)基因 1 号内含子基因多态性分布情况. 方法: 研究基于 PCR 后 Pvu II 和 Xb
5、a I 的酶切结果，PCR 模板 DNA 来自陕西省162 例无关个体，研究对象分为不同年龄和不同性别两组. 结果: PCR 扩增 ER 基因的 DNA 片段长度为 1.3 kb;经 Pvu酶切，得到 3 种 ER 基因型：P/P 型(1.3 kb)，P/p 型(1.3 kb ，850 和 450 bp)，p/p 型(850 和 450 bp)；经 Xba I 酶切得到的 3 种 1 号内含子基因型为：X/X 型（1.3 kb） ，X/x 型（1.3 kb，910 和 390 bp）和 x/x 型（910 和 390 bp）. 结论: 在陕西汉族非相关正常人群中 ER 基因 1 号内含子存在多
6、态性，基因型分布与年龄和性别不存在相关性. 【关键词】 雌激素受体基因；基因多态性；陕西汉族人群 0 引言 限制性片段长度多态性在基因组中普遍存在，据估计，人体基因组中平均异质性约为 15. 基因位点的多态性会影响基因的转录表达，进而通过影响基因产物来影响相关的生理功能1. 在对动脉粥样硬化遗传易感性研究过程中，发现女性在绝经前发病率明显低于男性，但绝经后与男性发病率相近，而动脉粥样硬化与雌激素的关系表明女性通过雌激素受体途径拮抗动脉粥样硬化. 我3们采用 AmpRFLP 技术对陕西汉族正常人群的雌激素受体基因（estrogen receptor gene, ER gene）多态性分布进行初步
7、研究，希望有助于从 DNA 水平更深入地了解 ER 基因多态性是否存在性别差异和年龄变化，以及相关疾病发生机制. 1 对象和方法 1.1 对象 随机抽取 162（男 98，女 64）例体质健康个体外周血血样，均为陕西省无血缘关系人群. 1.2 方法 对 162 例研究对象按照年龄和性别分为:少年组（718 岁）37 例，成年组（1940 岁）72 例，老年组（6074 岁）53 例；按照性别分为男女两组，男 98 例，女 64 例. 分别取静脉血 35 mL,生理盐水洗去血浆,加入 STE, SDS 和蛋白酶 K，37 过夜消化，酚/ 氯仿 /异戊醇 (体积比为 25241)抽提，无水乙醇和醋
8、酸钠沉淀，制备基因组 DNA. 引物序列分别为：5CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC3， 5TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA3. PCR 反应体系 50 L，依次加入灭菌双蒸水 32 L，10Buffer （含 Mg2+）5 L，2.5 mmol/L dNTP 4 L，引物各 2.5 L，模板 DNA 3 L. 97预变性 7 min，加入 Tag 酶 1 L（4 mmol/L） ，94变性 30 s，61复性 40 s，72 延伸 90 s，共 30 个循环，循环结束后72延伸 10 min. 取 PCR 扩增产物 8 L，1
9、4 g/L 琼脂糖凝胶 30 4mA 电泳 30 min，观察 PCR 结果. 取 20 L PCR 扩增产物，无水乙醇和醋酸钠沉淀，晾干后加入灭菌双蒸水 15.5 L 溶解，加入Buffer B 2 L, Acetylated BSA 2 L 和 6 U Pvu II 和 Xba I 于37分别酶切 34 h. 酶切产物经 15 g/L 琼脂糖凝胶（含溴乙锭）电泳分离，在紫外灯下判读并照相记录结果. 统计学处理：基因频率用直接算法，并按 HardyWeinberg平衡原理确认样本的群体代表性. 不同年龄、性别间等位基因频率差异用 2 检验. 2 结果 在正常人群中 ER 基因 1 号内含子分
10、别存在 3 种等位基因片段：P/P, P/p, p/p, X/X, X/x 和 x/x 型，琼脂糖凝胶电泳显示分别为 1 条、3 条和 2 条带，大写字母表示存在点突变而使该酶切位点消失，小写字母则表示存在该酶切位点. 陕西汉族正常人群 ER 基因1 号内含子经 PCR 后结果为 1.3 kb 大小的 1 条带,经 Pvu II 酶切可区分出 3 种基因型：P/P 型(1.3 kb)，P/p 型(1.3 kb，850 和 450 bp)，p/p 型 (850 和 450 bp)（Fig 1A）. Xba I 内切酶区分出的 3种基因型分别为：X/X 型（1.3 kb） ，X/x 型（1.3 k
11、b,910 和 390 bp）和 x/x 型（910 和 390 bp） （Fig 1B）. 陕西汉族人群中 ER基因 1 号内含子 PCR 片段为 1.3 kb，经 Pvu II 和 Xba I 酶切，以P/p 和 x/x 基因型分布最为广泛 . 经 Pvu II 酶切基因频率分布范围为 0.080.57，经 Xba I 酶切基因频率分布范围为 0.050.53. P 基因频率为 0.35，p 基因频率为 0.65；X 基因频率为 0.28，x 基因频5率为 0.72. 不同年龄组之间 ER 基因 Pvu II 酶切多态性分布无统计学差异（2=0.648, P0.95） ，Xba I 酶切多
12、态性分布无统计学差异（2=2.365, P0.50, Tab 1）. 性别之间差异也不显著：ER 基因 Pvu II 酶切多态性分布差异（2=0.621, P0.70） ，Xba I 酶切多态性分布差异（2=0.599, P0. 70, Tab 2）. 即 ER 基因PCR 扩增片段 Pvu II 与 Xba I 酶切多态性与年龄和性别不存在相关性. 表 1 不同年龄组 ER 基因 1 号内含子 Pvu II 和 Xba I 酶切结果（略）表 2 不同性别 ER 基因的内含子 Pvu II 和 Xba I 酶切结果（略） 3 讨论 ER 基因位于 6q2427,野生型全长 140 kb. 其
13、1 号内含子有两个高度多态性的 AFLP 位点，因其特殊位置可能会影响基因转录，所以引起研究者的关注. Ushiroyama 等2对日本 4246 岁绝经后妇女的骨矿密度与雌激素受体基因 1 号内含子多态性关系研究，发现骨矿密度与基因型之间的差异型：PPXx 杂合子基因型个体的骨矿密度明显偏低，但与其他基因型无显著关联；SapirKoren 等3对 183 例 1884 岁的男性和 161 例 2379 岁女性进行骨矿密度和 ER 基因多态性相关性研究，发现男性 ER 基因多态性与骨矿密度存在相关性趋势，但不存在显著的统计学意义，女性 ER 基因多态性与骨矿密度之间无相关性. Matsushi
14、ta 等4 对 133 例怀孕妇女骨矿密度与 ER 关系研究揭示两者之间存在相关性. 在对动脉粥样硬化遗传易感性研究过程中，我们发现女性在绝经前发病率明6显低于男性，但绝经后与男性发病率相近5 ，而雌激素的分泌与年龄不存在相关性6. 本研究结果显示，从少年组到老年组， ER基因 1 号内含子 Pvu II 和 Xba I 两个与动脉粥样硬化遗传易感性相关的位点均有多态性分布，P/P，X/X 较少见，P/p 和 x/x 基因型分布频率较高；结果与日本人种群基因频率相似2，3 ；ER 基因在正常男性和正常女性中分布频率极为相近，不存在性别差异. ER 基因 1 号内含子 Pvu II 和 Xba
15、I 两个研究位点不存在变化，说明在不同性别和不同年龄组之间，对动脉粥样硬化遗传易感性的敏感性和替代疗法存在的差异与其他限制性酶切位点可能存在相关性. 结合Shiozawa 等7实验，说明也可能与其他位点或者与 ER 基因其他的多态性形式如甲基化等相关. 【参考文献】 1 Urakami K, Wada Isoe K, Adachi Y, et al. Estrogen receptor gene polymorphisms in patients with Alzheimers disease, vascular dementia and alcoholassociated dementia
16、J. Dement Geriatr Cogn Disord，2000；11(3):119-122. 2 Ushiroyama T, Heishi M, Higashio S, et al. The association between postmenopausal vertebral bone mineral density and estrogen receptor gene alleles in ethnic Japanese living in western JapanJ . Res Commun Mol Pathol Pharmacol，2001；109(12):15-24. 3 SapirKoren R, Livshits G, Landsman T, et al. Bone 7mineral density
