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1、 第十三章高效液相色谱法HPLC 分析化学 下 第三版 高效液相色谱法 以气相色谱为基础 在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 主要内容 一 概述二 基本理论及条件选择三 各类高效液相色谱法四 影响分离的因素五 高效液相色谱仪六 超效液相色谱技术简介七 HPLC定量分析方法学考察八 HPLC应用 第一节概述 一 HPLC与经典LC区别二 HPLC与GC差别三 高效液相色谱仪流程图四 特点 一 HPLC与经典LC区别 主要区别 固定相差别 输液设备和检测手段 1 经典LC 仅做为一种分离手段柱内径1 3cm 固定相粒径 100 m且不均匀常压输送流动相柱效低 H n 分析周期长无法
2、在线检测2 HPLC 分离和分析柱内径2 6mm 固定相粒径 10 m 球形 匀浆装柱 高压输送流动相柱效高 H n 分析时间大大缩短可以在线检测 二 HPLC与GC差别 相同 兼具分离和分析功能 均可以在线检测主要差别 分析对象的差别和流动相的差别 1 分析对象GC 能气化 热稳定性好 且沸点较低的样品 高沸点 挥发性差 热稳定性差 离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20 HPLC 溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大 难气化 热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛 占有机物的80 续前 2 流动相差别GC 流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力 只与
3、固定相作用HPLC 流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力 为提高柱的选择性 改善分离度增加了因素 对分离起很大作用流动相种类较多 选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性 3 操作条件差别GC 加温操作HPLC 室温 高压 液体粘度大 峰展宽小 三 高效液相色谱仪流程图 续前 四 HPLC的特点和应用 三高 一快 一广 高柱效 n 104片 米 柱效高 远高于一般LC 高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛 可分析80 有机化合物 第二节基本理论和条件选择 一 塔板理论 平衡理论二 速率理论 Vander方程三 HPL
4、C法中分离条件的选择 一 塔板理论 二 速率理论 与GC对比 1 续前 2 涡流扩散项及其影响next 2 讨论 1 流动相流速对HPLC板高的影响 与GC对比 next 图示 back 续前 3 传质阻抗项及其影响 图示 三 HPLC法中分离条件的选择 1 固定相与装柱方法的选择 选粒径小的 分布均匀的球形固定相 dp 10 m 首选化学键合相 匀浆法装柱2 流动相及其流速的选择 选粘度小 低流速的流动相 甲醇 1ml min3 柱温的选择 选室温250C左右 第三节各类高效液相色谱法 一 液固吸附色谱法 LSC 二 液液分配色谱法 LLC 三 化学键合相色谱法 BPC 一 液固吸附色谱法
5、LSC 流动相为液体 固定相为固体吸附剂 1 分离机制 利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 分离前提 K不等或k不等 续前 2 固定相 与LC比 固定相粒径不同 10 m 2 高分子多孔小球 YSG原理 吸附 分配蒹小孔凝胶作用特点 柱选择性好 峰形好 柱效低适用 分离弱极性化合物 续前 3 流动相 底剂 烷烃 有机极性调节剂例 正己烷或庚烷 氯仿 4 影响k的因素 与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性 洗脱能力 k tR 溶剂系统极性 洗脱能力 k tR 注 调节溶剂极性 可以控制组分的保留时间5 出柱顺序 强极性组分后出柱 弱极性组分先出柱6 硅胶吸水量 LSC LLC硅
6、胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量 17 分配色谱硅胶失活 载体吸附的水 固定液 二 液液分配色谱法 LLC 1 分离机制 利用组分在两相中溶解度的差异2 固定相 载体 固定液 物理或机械涂渍法 缺点 系统内部压力大 易流失 不实用固定液 极性 NLLC固定液 非极性 RLLC3 正相色谱 固定液极性 流动相极性 NLLC 极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱 固定液极性 流动相极性 RLLC 极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱适于分离非极性组分 三 化学键合相色谱法 BPC 一 化学键合相 bondphase 二 反相键合相色谱 reversedbond
7、phase 三 正相键合相色谱 normalbondphase 四 离子对色谱和离子抑制色谱 ion pairchromatography ion presschromatography 一 化学键合相 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1 分离机制 分配 吸附 以LLC为基础 2 特点 1 不易流失2 热稳定性好3 化学性能好4 载样量大5 适于梯度洗脱 二 反相键合相色谱 1 分离机制 疏溶剂理论正相 流动相与溶质排斥力强 作用时间 k 组分tR 反相 流动相与溶质排斥力弱 作用时间 k 组分tR 2 固定相 极性小的烷基键合相C8柱 C18柱 ODS柱 HPLC约80 问题 3
8、 流动相 极性大的甲醇 水或乙腈 水流动相极性 固定相极性底剂 有机调节剂 极性调节剂 例 水 甲醇 乙腈 THF 续前 4 流动相极性与k的关系 流动相极性 洗脱能力 k 组分tR 5 反相洗脱 强度因子S 见P291表13 5 水的洗脱能力为0 6 出柱顺序 极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱7 适用 非极性 中等极性组分 HPLC80 问题 三 正相键合相色谱 1 分离机制 溶质分子与固定相之间定向作用力 诱导力 或氢键作用力2 固定相 极性大的氰基或氨基键合相3 流动相 极性小 同LSC 底剂 有机极性调节剂例 正己烷 氯仿 甲醇 氯仿 乙醇 续前 4 流动相极性与k的关系 流动相极
9、性 洗脱能力 组分tR k 5 正相洗脱 溶剂的洗脱能力主要参考极性参数P 见P290表13 3 6 出柱顺序 结构相近组分 极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6 适用 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似 极性稍小 分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大 碱性分析极性大物质 糖类等 四 离子对色谱和离子抑制色谱 1 反相离子对色谱法 ion pairchromatography 2 反相离子抑制色谱 ion presschromatography 1 反相离子对色谱法 IPC或PIC 反相色谱中 在极性流动相中加入离子对试剂 使被测组分与其中的反离子形成中性离子对 增加k和tR 以改善分离 1
10、 离子对试剂 烷基磺酸钠 分析碱四丁基季胺盐 分析酸2 影响k的因素a 与m的极性有关 同反相色谱 b 与R的链长有关 R 长 极性 小 tR k 3 适用 较强的有机酸 碱 2 反相离子抑制色谱 在反相色谱中 通过加入缓冲溶液调节流动相pH值 抑制组分解离 增加其k和tR 以达到改善分离的目的 1 离子抑制剂 弱酸 弱碱性物质pH一定的缓冲溶液2 k的影响因素 与流动相极性有关 还与pH值有关选择流动相 应同时考虑极性及pH值酸性物质 加入酸HActR k 碱性物质 加入碱NH3 H2OtR k 调节pH范围 3 0 8 0pH 8 0破坏键合相与载体的结合pH 3 0腐蚀柱子3 适用 极弱
11、酸碱物质pH 3 7弱酸 pH 7 8弱碱 两性化合物 分离类型选择 第四节影响分离的因素 一 分离度二 流动相三 洗脱方式 1 续前 2 对流动相的要求 1 与固定液不反应2 对样品有良好溶解度k 1 10k 2 5最理想的3 与检测器匹配 UV 常用 测定波长应大于溶剂的截止波长 荧光 电化学4 使用粘度小 纯度高的流动相 甲醇 乙腈 使用前过滤 脱气 续前 3 洗脱方式 1 等度洗脱 恒组成溶剂洗脱 以固定配比的溶剂系统洗脱组分 一个泵 类似GC的等温度洗脱2 梯度洗脱 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性 两个泵 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温
12、沸程较长样品 图示 第五节高效液相色谱仪 HPLC仪器示意图 HPLC的基本流程图 流动相 泵 色谱柱 检测器 泵液 分离 检测 记录 进样阀 进样 1 泵 恒压泵 流量精度不稳恒流泵 常用2 进样装置1 隔膜进样 高分子有机硅胶垫 进样室 GC系统压力较小 可以HPLC系统压力太大 必须停泵进样 早期 2 阀进样 不必停泵 六通阀 进样阀 样品 装样 废液 淋洗液 至分离柱 六通阀 样品环 续前 3 色谱柱 直径4 6mm 柱长10 30cm柱效评价 色谱系统适应性试验R n fs 拖尾因子 柱再生 维护 保养 柱子的冲洗4 检测器1 紫外检测器 适于吸收紫外光的物质2 荧光检测器 只能分析
13、自身发光的物质灵敏度高3 示差折光检测器 利用折光率的差别灵敏度低 温度要求严格4 电化学检测器5 化学发光 光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 光电二极管阵列检测器 第六节超效液相色谱技术简介 UPLC 原有HPLC分析需要4个不同的方法 三根不同的色谱柱 至少需要65分钟才能完成 LC MS联用可容纳600个色谱峰 第七节HPLC定量分析方法学考察 准确度 回收率实验 精密度 重复性实验 检出限 3S N 定量限 10S N 线性范围 2个数量级 色谱系统适用性实验柱效 理论塔板数 分离度重复性拖尾因子 第八节HPLC的应用
14、药物分析 食品分析 环境分析 农药分析 例题 在反相色谱中 若以甲醇 水为流动相 适当增加甲醇的比例时 组分的容量因子和保留时间的变化为 A样品的k降低 tR降低B样品的k增加 tR增加C样品的k增加 tR降低D样品的k降低 tR增加 例题 在正相色谱中 若适当增大流动相极性 则 A样品的k降低 tR降低B样品的k增加 tR增加C相邻组分的 增加D对 基本无影响 例题 HPLC中的最佳流速uH与GC中的最佳流速uG比较结果是 AuH uGBuH uGCuH uG 例题 用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品 以某一比例甲醇一水为流动相时 样品容量因子较小 若想使容量因子适当增加 较好的办法是 A增
15、加流动相中甲醇的比例B增加流动相中的水的比例C流动相中加人少量HAcD流动相中加人少量的氨水 例题 在液相色谱中 常用作固定相又可用作键合相基体的物质是 A分子筛B硅胶C氧化铝D活性炭 例题 水在下述 中洗脱能力最弱 作为底剂 A正相色谱法B反相色谱法C吸附色谱法D空间排阻色谱法 例题 键合相的键合基团的碳链长度增加后 A极性减小B极性增大C载样量增大D载样量减小 例题 在分配色谱法及化学键合相色谱法中 选择不同类别的溶剂 分子间作用力不同 以改善分离度 主要是 A提高分配系数比B容量因子增大C保留时间增长D色谱柱柱效提高 例题 二极管阵列检测器与一般分光光度计的主要差别是 A不需光谱扫描即可
16、获得样品每个组分的吸收光谱B服从Lambert Beer定律C复光照射样品 而后再分光D信号弱 需要累加 例题 内标对比法与内标一点法的区别是 A不需要加内标物B不需要校正因子C进样量不要准确 例题 用反相HPLC测定样品中的芦丁含量 选对氨基苯甲酸为内标 方法如下 准确配制1mg mL浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲酸对照溶液 精取芦丁对照溶液2 00mL 4 00mL 6 00mL 8 00mL 10 00mL 分别置于25mL容量瓶中 同时各加入内标溶液2 00mL 定容 各进样3次 进样量为10 L 得芦丁色谱峰面积和内标物峰面积之比的平均值分别为1 43 2 86 4 29 5 37和7 16 精称样品0 2070g 溶解 定容于100mL容量瓶中 精取10 00mL于25mL容量瓶中 同时加入内标溶液2 00mL 定容 进样量为10 L 3次进样得芦丁色谱峰面积与内标物峰面积之比的平均值为5 10 计算样品中芦丁的含量 本章小结 1 掌握高效液相色谱的速率理论表达式 并比较与GC的异同 2 掌握液液分配色谱中化学键合相的特点及分类 3 掌握HPLC仪器组成和主要部件的特点 4
