基因枪介导法转化 基因枪技术是一种将核酸直接发送至细胞内的物理学方法 PDS 1000 H台式基因枪可以实现对细胞的原位转导 应用于包括培养细胞 组织 器官 植物 动物 细菌和细胞器官等各种不同的目标 目标区域 大 40c 压力范围 450 2 200psi 目标类型 动物 细胞和器官培养植物 小的整体植株 培养细胞和外植体真菌 细菌和其他微生物细胞器官 叶绿体 线粒体 PDS 1000 H台式基因枪 基因枪介导转化法原理 利用火药爆炸或高压气体加速 这一加速设备被称为基因枪 将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中 然后通过细胞和组织培养技术 再生出植株 选出其中转基因阳性植株即为转基因植株 与农杆菌转化相比 基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制 而且其载体质粒的构建也相对简单 因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法 基因枪介导法转化 材料 目的基因 受体组织 愈伤组织 茎尖组织 叶片组织等离体及活体组织 基因枪轰击金粉 钨粉 包埋试剂盒 试剂系列培养基 1 常规培养基 愈伤诱导培养基 增殖培养基 分化培养基 筛选培养基 生根培养基2 高渗培养基 愈伤诱导培养基或继代培养基中加入0 1 0 3mol l的甘露醇和山梨醇 提高渗透压 3 筛选培养基 与各自基因及载体相关 操作步骤一 受体材料的预处理洋葱表皮细胞的准备 将洋葱剥掉4 5层葱片 将靠近心部的葱片切成1 5cm 1 5cm左右的小快 小心撕取内表皮 置于MS固体培养基上25 暗培养过夜 水稻 在基因枪轰击枪前先将材料转入高渗培养基中预先培养4 6个小时 9cm的培养皿 二 微弹载体的制备1 金粉或钨粉悬浮液的制备 1 称取6mg金粉或钨粉于1 5ml离心管中 加入1ml无水酒精 充分涡旋 Votex 1 2min 然后静止数分钟 10000r min离心10sec 2 小心去除上清夜 加入1ml无菌水 充分涡旋 Votex 1 2min 然后静止数分钟 10000r min1离心0sec 3 重复步骤2次 4 小心去除上清夜 加入100 l无菌水 待用 2 DNA包埋 1 取50 l悬浮好的悬浮液1 5ml于离心管中置于涡旋器上缓慢涡旋 同时加入5 gDNA 2 加入20 l新鲜配置的0 1M亚精胺 缓慢涡旋 3 一滴一滴加入50 l2 5M的CaCl2 缓慢涡旋 4 室温放置10min 12000r min离心10sec 5 小心去处上清夜 加入60 l无水酒精 缓慢涡旋 待用 多胺在适宜的pH条件下 以多聚阳离子态存在 易和带负电荷的核酸和蛋白质结合 即多胺上的氨基和亚氨基与核酸的磷酸基结合 稳定了核酸的二级结构 有助于DNA的复制 CaCl2使DNA慢慢聚集 沉淀 在金粉 钨粉 周围 三 装弹 BiolisticRPDS 1000 HeBIO RAD 将台式基因枪放置于一个较大型的超净工作台上 以便于无菌操作 1 用70 75 的酒精擦净真空室及表面 2 用75 酒精浸泡消毒可裂膜 子弹载膜 并用无菌滤纸吸干 3 用100 的酒精浸泡阻挡网和子弹载膜器 并用明火烧干 4 打开电源开关 真空泵及氦气瓶阀 5 将子弹载膜置于子弹载膜器上 吸10 lDNA 金属包埋悬浮液 充分悬浮 涂布于子弹载膜中间 于工作台上吹干 6 将可裂膜装入固定盖 旋紧 7 将阻挡网和载有子弹载膜的子弹载膜器装入微粒子弹发射装置中 8 将欲转化的靶组织放入轰击箱内 待轰击 四 轰击 1 抽真空 按VAC vaccum 键 当真空度达到需要值 25 27inchesHg 时 将VAC键转到HOLD位置 2 轰击 按FIRE键直到可裂膜爆破 再桉VENT键放气 取出样品 完成轰击 五 恢复培养将轰击后的材料在高渗培养基中培养过夜 然后继代到不含抗生素的继代培养基中恢复1 2周 以利于受轰击细胞的恢复及外源基因的表达 六 筛选培养将恢复培养基的材料转入含有相应抗生素的筛选培养基中进行抗生素筛选 一般3周左右为一个筛选周期 筛选2 3次 抗性组织可进行下步分化 生根培养 生根植株移栽温室 可用于转基因植株的分子生物学鉴定及田间生物学检测 注意 1 在转化前 首先应该建立此物种的高效再生体系 以确保转化频率 2 金粉和钨粉是基因枪转化中最常用的金属颗粒 钨粉比较便宜 弹与DNA结合时间过长会催化性降解DNA并对某些细胞产生毒害 金粉大小一致 不会引起DNA的降解 对细胞也无毒性 但金粉的水溶液趋向不可逆的结块 需要现配现用 Gus染色和显微镜观察将带有轰击过的洋葱表皮的培养皿在25 下倒置培养16 24h 水稻愈伤组织过夜培养 取出转化组织将置于X Gluc的溶液中 37 下染色直至蓝色斑点出现 2h 以上 将染色后的洋葱表皮用ddH2O漂洗数次后 将内表皮朝下放于载玻片上 盖上盖玻片后在Leica显微镜下观察 并用STOP软件获图象 Gus染色原理 Gus基因编码的是 葡糖醛酸苷酶 glucuronidase E C 3 2 1 31 克隆自Escherichiacoli E coli K12 gusA uidA Gus可以水解葡糖苷酸 形成葡糖醛酸 兰色 底物 X gluc 5 bromo 4 chloro 3 indolyl D glucuronide 葡糖醛酸苷酶 glucuronidase E C 3 2 1 31 底物 X gluc 5 bromo 4 chloro 3 indolyl D glucuronide 葡糖苷酸 葡糖醛酸 兰色 Gus染液 100mM的磷酸缓冲液 pH7 0 10mM的EDTA pH8 0 0 1 Triton 1001mMX gluc 。