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1、微 生 物 实 验 论 文功能微生物的筛选和选育 本 科 生：指导教师：培养单位：学科专业：完成时间：前言：微生物与我们的生活息息相关，在生产实践中起着重要的作用。比如一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一些微生物能够降解塑料、处理废水废气；另一些微生物能产生抗生素，被大量应用于生物制药领域微生物产业在21世纪将呈现全新的局面。微生物从发现到现在短短的300年间，特别是20世纪中叶，已在人类的生活和生产实践中得到广泛的应用，并形成了继动、植物两大生物产业后的第三大产业。这是以微生物的代谢产物和菌体本身为生产对象的生物产业，所用的微生物主要是从自然界获得的高产菌种。那么
2、如何从自然界中得到高产菌株呢？这就是接下来我要探讨的问题。摘要：本论文通过培养基制备及灭菌、菌种分离纯化、菌种鉴定、培养条件优化以及诱变育种等五个实验，从土壤中筛选获得产淀粉酶细菌和选育高产菌株。从而掌握相关实验技术和方法，学会如何应用这些技术去解决科学实验和生产实践中的具体问题。关键词：筛选、选育、诱变育种、高产菌株Abstract: This paper through culture medium preparation and sterilization, isolation purification, identification, optimization of culture c
3、onditions and mutation breeding of five experiments, screened from soil to obtain amylase produced bacteria and breeding high yield strains. In order to grasp the related experimental techniques and methods, learn how to apply these techniques to solve scientific experiments and production practice
4、of the specific problems.Key words: screening, breeding, mutation breeding, high yield strain实验原理：在自然界的土壤中存在产淀粉酶的细菌，通过土样悬液稀释涂布和平板划线分离于含有淀粉的培养基上，诱导产生淀粉酶。产淀粉酶的细菌可在菌落周围水解淀粉出现水解圈。滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。通过计算水解圈大小（H）和菌落大小（C）的比值获得产淀粉酶能力强的菌落。通过形态学鉴定和分子鉴定确定产淀粉酶菌株的种类。并将之转接于不同条件的液体摇瓶发酵培养基中培养一段时间后，计算淀粉酶酶活，得到最佳培养条
5、件。然后在紫外线下照射，对诱变后的菌种进行筛选和复筛得到产淀粉酶的高产菌株。1材料和方法1.1样品采集分离样品来源：2010年 11 月 15 日于33幢宿舍楼下花坛采集土壤若干，装于信封中。鉴别培养基为淀粉培养基、优化培养基为摇瓶发酵培养基。1.2方法1.2.1产胞外淀粉酶细菌的分离和筛选将新鲜土样依次稀释至10-3、10-4 稀释度，分别涂布于淀粉培养基中，再将10-1 的土壤稀释液在一块淀粉培养基上进行划线分离，将这3块培养基倒置于恒温箱培养。24小时后，选取典型细菌菌落，并用记号笔进行编号。将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的1块淀粉培养基平板上分别点种。在3块淀粉培养基滴加路哥氏碘
6、液显色，观察水解圈并测量菌落大小(C) 和水解圈大小(H) 。找到水解圈最大的1-2个菌落和编号，在对应编号的点种平板上做好标记。将点种平板继续置于30培养。1.2.2产淀粉酶菌种的鉴定（一）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定 首先进行培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等；再用显微观察细菌细胞：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？最后对细菌进行革兰氏染色：是革兰氏阳性菌还是阴性菌。 (二)细菌的16S rDNA分子鉴定从平板上取单菌落加入20l无菌水，100加热10 min。轻微离心后，取5l作为模板。 反应体系：在
7、一个PCR管中用微量移液枪依次加入列物质： Taq buffer（10）2.5l MgCl2（25mM） 1 l dNTP（2.5 mM）2.5 l Primer Forward（50 mM） 1 l Primer Reverse（50 mM） 1 l ddH2O 16.5 l rTaq（2U/l） 0.5 l PCR反应条件：95预变性5 min后，95变性1 min，59退火1min，72延伸1min，共25个循环，72延伸10min。（三）琼脂糖凝胶电泳1.制胶：配制0.7%琼脂糖溶液20mL，用1TAE电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固； 2.制样：PC
8、R反应结束后，取出PCR管，吸取5 l与1l 6样品Buffer混合后全部点入浸于TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中； 3.电泳：100V电泳20min； 4.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb），则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的PCR反应管放置冰箱短期保存。 （四）PCR扩增片段测序 获得的PCR阳性样品由专人送往测序公司进行测序，大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上进行读序。（五）序列比对分析 使用NCBI 网站对待测菌的16SrDNA 序列与数据库中各种菌的1
9、6SrDNA 序列进行比对。登陆http:/www.ncbi.nlm.nih.gov 美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从Genebank 中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的16SrRNA基因序列, 初步确定待测菌的分类位置。用Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的16SrRNA序列进行多序列比较。1.2.3培养条件的优化（一）发酵液接提前24h将平板菌种用接种环挑取，在液体试管中打散混匀，然后按0.5接种量分别转接如下六种液体摇瓶发酵培养基。1.pH 4.0 2
10、. pH 7.23.碳源淀粉 4.碳源葡萄糖5.氮源硝酸钠 6.氮源硫酸铵(二)菌种保藏挑取平板菌落，在斜面试管培养基上划线，30培养，然后置冰箱低温保藏。(三) 菌体生长量的测定将培养24h后液体摇瓶培养物分别取出2mL于试管中，加入8mL蒸馏水，进行5倍稀释。将各稀释液分别倒入比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(OD600值)。分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。（四）不同条件对淀粉酶活性的影响测定加入试剂测定管空白管1的淀粉溶液0.1mL0.1mL缓冲液0.1mL0.1mL摇匀后40恒温水浴保温5min发酵液0.2mL-蒸
11、馏水-0.2mL摇匀后40保温15min乙酸溶液0.5mL0.5mL8000rpm离心5min取上清,加入1mL稀碘液试管中加蒸馏水稀释至10mL计算淀粉酶酶活：显色后，立即于660nm波长测定其吸光度（A）。计算各样品吸光度大小酶活力。即以1mL粗酶液在40，pH6.0条件下15min所分解0.1mg的淀粉质量为1个酶活力单位。 A空白管 A测定管A空白管（ ）115150.20.1100.1比较各发酵菌液酶活力，判断哪种培养条件下酶活力最高。1.2.4产淀粉酶菌种紫外诱变育种(一)菌种的活化与接种培养24 h后，挑取一环活化菌株，接种至含10ml淀粉培养基的50ml三角瓶中，于25，150
12、 r/min的摇床中振荡培养。(二) 诱变1.菌悬液的制备：取出培养约24h 的摇瓶，分别取1ml菌悬液（吸取前三角瓶要摇匀）于2个离心管中，5000 r/min离心5min，弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，加入1.5ml无菌生理盐水制成菌悬液。2.平板制作：融化淀粉培养基，倒4块平板，在平板上做好标识。3. 诱变处理：(1)开启紫外灯预热10-20 min。(2)紫外处理：取制备好的菌悬液3 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床上，打开皿盖，距离紫外灯管 30cm，照射3min，盖上皿盖。(3)稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按10倍稀
13、释法依次稀释成10-1-10-5（dorf管中稀释）。(4) 涂布平板：取10-3、10-4（紫外照射3min）两个稀释度的菌悬液各0.1ml涂布均匀。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。平板于37倒置培养48 h(用黑布包好平板)。 （三）计算成活率和致死率1. 存活率：将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。2致死率：将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。（四）观察诱变效应在平板菌类计数后，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加入碘液，分别测量透明
14、圈直径与菌落直径并计算比值(H/C值)，与对照平板进行比较（紫外照射和对照组随机选出6个算平均值）。选取H/C 比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面上培养，用于复筛。2结果与分析2.1细菌的分离与鉴定：在10-3的培养基上典型的菌落有12个分别编号112；在10-4的培养基中有7个分别编号为1319；在划线培养基中有5个分别编号为2024。滴加碘液显色后发现5、13、17、18、21的水解圈明显较大。计算其H/C值得表如下：菌落号513171821水解圈直径(H)mm3.22.61.82.92.4菌落直径(C)mm1.20.70.50.90.7H/C值2.673.713.63.223.43得13号菌株为最佳菌株。2.2 产淀粉酶菌种的鉴定：形态特征的观察与鉴定：菌落为乳白色，较小，中央有微小隆起，表面较光滑。革兰氏染色为紫色，说明为阳性菌。显微镜下为长杆状，个体较大。琼脂凝胶电泳结果：泳动较慢，说明该菌的DNA分子的分子量较大。PCR扩增片段测序：通过序列比对分析初步确定为超大芽孢杆菌。2.3培养条件的优化：OD600值计算：测得的OD600的值如下：试管号123456OD600值0.7270.8950.7950.0870.719
