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1、 攀枝花学院 Panzhihua University教 案 20112012学年度第一学期课 程 名 称 微生物学实验 学 时(学 分) 22（1.5） 适 用 班 级 2010级生物工程班 授 课 教 师 曹 慕 岚 教 师 职 务 讲 师 教 学 单 位 生物与化学工程学院 教 务 处 制实验教案编写说明1、实验教案的编写要求参照攀枝花学院教案编写规范（攀院教200704号）执行。2、实验教案格式可按附后“实验教案”格式采用手写或打印。3、实验教案的基本内容可包括：教学目的与要求、教学重点与难点、仪器设备及用具、教学过程(含实验预习检查实验原理及方法仪器设备介绍实验内容及注意事项实验指导
2、要点检查实验结果)、实验预做记录(含原始实验数据记录数据处理及结果分析)、实验预习要求、实验报告要求、参考书目、后记等相关内容。4、实验教案编写应在坚持教案编写基本要求的基础上，充分考虑教师自身条件和学科的差异，针对教师、学科、学生以及教学情景的不同，编写出形式多样，能体现教学风格、具有特色的教案，促进教案的创新。5、教案编写水平的高低，很大程度上取决于教师钻研教材与实验方法，研究学生实际状况和设计教学方法的水平，取决于教师对本学科知识掌握的深度和广度以及教师教育思想的端正更新。因此，教师应努力提高自身素质，提高教师教案编写水平。实 验 教 案实验课程名称微生物学实验实验学时22独立设课 非独
3、立设课实验课类别1.基础 2.专业基础 3.专业 4.其它任课教师曹慕岚职称讲师授课对象年级：2010级 专业：生物工程 班级： 本科专科教材和主要参考资料教材：沈萍等主编.微生物学实验M.高等教育出版社.2006年.主要参考资料：1、焦瑞身,周德庆主编.微生物生理代谢实验技术.科学出版社.2、范秀容,李广武.微生物学实验（第二版）.高等教育出版社3、周德庆.微生物学实验手册.上海科学技术出版社.教学目的和教学要求掌握显微技术、接种技术、灭菌技术、菌种培养与保藏等方面的基本概念、基本理论和基本技能，为今后学习专业方向课奠定必要的基础。教学重点和教学难点重点：各种微生物学的基本实践技术难点：各种
4、微生物学的基本实践技术教学进程安排课次实验项目（实验内容）学时备 注1显微镜使用、细菌简单染色及革兰氏染色实验42放线菌、霉菌形态观察实验43酵母菌形态观察和大小测定实验44细菌培养基配制细菌的培养实验65实验考试4实 验 教 案课题(项目)名称: 显微镜使用、细菌简单染色及革兰氏染色计划学时: 4 实验类型: 1.演示性 2.验证性 3.综合性 4.设计性 5.其它授课日期: 2012 年 4月 3 日 第7 周 星期 二 第 5/6/7/8 节实验一 显微镜使用、细菌简单染色及革兰氏染色一、目的要求1、学习并掌握油镜的原理和使用方法2、复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法3、学
5、习微生物涂片、染色的基本技术4、掌握细菌的简单染色法5、初步认识细菌的形态特征6、巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术7、学习并初步掌握革兰氏染色法8、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性二、基本原理1、显微镜的工作原理：普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大15002000倍。普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统。在显微镜的光学系统中物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。2、细菌简单染色及革兰氏染色的基本原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和
6、中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳
7、性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、器材1、活材料：培养12-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）2、染色液和试剂：结晶紫（
8、附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜四、操作步骤1、显微镜的使用（1）观察前的准备1）显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2）将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3）调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，
9、用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4）调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。（2）低倍镜观察镜检任何标本都要
10、养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。（3）高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节
11、光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。（4）油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1）先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油
12、中，使镜头几乎与标本接触。4）从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5）观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6）将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降
13、下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。2、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色
14、：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。3、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜
