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1、生物技术大实验讲义实验一 枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的拮抗作用 实验目的： 进一步掌握无菌操作技术，加深对微生物之间互作的进一步认识 实验原理： 枯草芽孢杆菌分泌到体外的带谢产物能够抑制棉花黄萎病的生长 供试菌株 (1) 拮抗菌株: 枯草芽孢杆菌（冰箱保存）(2) 病原菌株: 棉花黄萎病菌（冰箱保存） 实验步骤1. 培养基的制作(1) PD培养液：(2) PDA培养基：查氏培养液：按上述配方配制查氏液体50 ml及固体胶培养基125 ml分别装在250的三角瓶中，121 条件下灭菌30分钟。2. 接种培养(1) 在无菌操作条件下，将棉花黄萎病菌接种在查氏培养液中，28振荡培养4天。(2) 将枯草
2、芽孢杆菌在PD培养液中28培养24小时3. 抑菌试验(1) 平板制备：将固体PDA培养基溶化后倒入培养皿中，制成平板(2) 棉花黄萎病菌液涂皿：将棉花黄萎病菌液用玻棒均匀的涂布在查氏平板培养基上(3) 枯草芽孢菌的接种：将圆滤纸片放置在平板培养基上，用吸管吸取少许枯草芽孢杆菌菌悬液滴到滤纸片上(4) 培养：28 培养箱中培养4天(5) 观察结果 实验二 酶联免疫法测ABA含量仪器： 酶联免疫仪 酶标板 752分光光度计实验原理 本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定
3、板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。测定方法1、 包被：在微量滴定板内准确加入100LABA包被液，37湿盒过夜。2、 标样稀释?：取8支试管每管
4、加150LDB，第一管中加入50L（2000ng50L）标准液，充分涡旋后，取50L至第二号管中，同样涡旋后，取50L到第三管；依次稀释到第六管，稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng50L。3、 洗板：从37湿盒中取出滴定板，恢复到室温后，弃去包被液，用WB（洗涤缓冲液）洗涤三次，甩干（吸水纸）。4、 加样：18孔对应加入ABA标样50L，10号孔相应加入最浓ABA标样，9号孔加50LDB，三排重复；然后每孔加50L抗体，37 45分钟。5、 洗板：6、 加酶标二抗：每孔加100L，37反应1
5、小时。7、 洗板：8、 显色：各孔加10LOPD显色液，37 20分钟。9、 终止反应：各孔加50L 6NH2SO4。10、 读数：490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),18号孔的OD值为B。11、 结果计算：以In（B/B0）（1B/B0）为纵坐标，以标准ABA浓度的常用对数（lgABA）为横坐标,绘制曲线。实验三 质粒DNA的提取及其酶切实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA 。实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解
6、开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。实验步骤（一） 提取质粒1. 将2 ml 含相应抗生素的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落，37振荡培养过夜。2. 取培养物倒入微量1.5ml离
7、心管中，4000 r/min 离心 2 min。3. 弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。4. 加入100ul溶液，充分混匀，室温放置10 min。 5. 加200 ul溶液 （新鲜配制），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上 5 min 。6. 加入150 ul 溶液 （冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15 min 。7. 12000 r/min ,离心15 min ，将上清转至另一离心管中。8. 加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000 r/min，离心5 min，将上清转移到另一离心管中。9. 加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置510 m
8、in。12000r/min离心 5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10. 用1 ml 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11. 加50 ul TE缓冲液，其中含有20 ug/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，20保存。（二）酶切取DNA溶液，加酶切缓冲液，EcoRI酶1 ul，无菌水补至总体积10 ul，37保温3h,加终止液，准备下个实验电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。实验四 琼脂糖凝胶电泳技术实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。D
9、NA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circu
10、lar DNA，简称 CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。 实验步骤(一) 制备琼脂糖凝胶电泳槽及用胶量将琼脂糖按比例溶入1X TAE缓冲液中，微波炉加热至完全溶化，冷却至60, 加入适量EB, 混匀。 （二）胶板的制备1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的
11、两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。梳子调整齐3. 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将胶槽放在电泳槽内。5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。 （三）加样, 用移液器将已加入上样缓冲液的DNA样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。 （四）电泳1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。
12、 （五）染色将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。实验五 真核生物高分子量DNA制备实验原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。实验材料: 新鲜植物叶片实验步骤1. 取4g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状（越细越好）。2. 转移至50ml离心管中，加入16ml TENbf，充分混匀。65水浴保温20min。3. 从水浴中取出离心管，加入5ml 5 mol/L KCl溶液，混匀，水浴20mi
13、n。4. 4000r/min 离心 20 min。5. 将上清液转移到另一50ml离心管中。6. 加等体积酚氯仿混匀，12000rmin 离心5min，取上清。7. 加等体积氯仿，混匀，12000rmin 离心5min，取上清。8. 加入0.61倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。放置时间9. 离心获得沉淀，70乙醇洗3次。风干沉淀。10. 加入500LTE缓冲液，溶解DNA。11. 取3L上清液,琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。 实验六 PCR基因扩增实验目的：掌握PCR反应的基本原理与实验技术实验原理：PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以
14、选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸变性退火延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。1 变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.2 退火：使溶液温度降至5060，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3 延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导
15、下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按53方向复制出互补DNA.上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。一、 仪器、实验用品、试剂一、仪器PCR仪冰箱电泳仪微波炉电泳槽离心机紫外检测仪二、试剂PCR BufferTAE(500ml)Ice琼脂糖Tag溴化乙锭d NTPs溴酚蓝模板DNAmarkerPrimer1Primer2石蜡油三、其它用品移液器 （一套）Tip（一套） PCR
