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1、微 生 物 实 验 教 案第一部分 基础性实验实验一 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察一、实验目的以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。二、显微镜油镜使用的原理1普通光学显微镜的基本构造（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=/2nsin(
2、/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m）n: 物镜和被检标本间介质的折射率。a：镜口角（即入射角）。3油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料 1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。2细菌三种形态的玻片染色标本。3培养12-18h的枯草芽孢杆菌。四、实验方法与步骤1染色细菌玻片的油镜观查（1）用前检查
3、：零件是否齐全，镜头是否清洁。（2）调节光亮度。（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。（6）绘出所观察到的细菌形态图像。（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。2、活菌制片观察取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12
4、-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。五、实验报告油镜使用的原理 六、思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2使用油镜时，为什么必须用镜头油？3镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？七、实验注意事项1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4观察时，两
5、眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。6显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、实验原理1 简单染色的原理大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。2 革兰氏染色的原理革
6、兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。三、实验材料1大肠杆菌24h的斜面培养物。2葡萄球菌24h的斜面培养物。3简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）5载玻片、盖玻片、接种环、镊
7、子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。四、实验方法和步骤附表1细菌染色法分类附表2 微生物染色常用染料A酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。B碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。C中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。D单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料1、简单染色(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻
8、片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。(3) 固定:于火焰上通过23次。(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色分钟。（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。（7）镜检：在油镜下观察细菌形态。2革兰氏染色（1）涂片。（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色
9、约30秒，后立即用流水冲洗。（5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。（6）镜检：观察染色结果。五、实验报告1 革兰氏染色的基本原理和意义2 革兰氏染色成败的关键六、思考题1根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？ 2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠?实验三 细菌的鞭毛染色及其运动观察一、实验目的1学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。2用压滴法观察细菌的运动3用悬滴法观察细菌的运动二、实验原理鞭毛是
10、细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01-0.02m，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。三、实验材料1 菌种：普通变形杆菌斜面菌种2 鞭毛染色液：A液，B液。3 0.01的美蓝水溶液、无菌水，凹玻片、载玻片，盖玻片、香柏油、镊子、酒精灯、擦镜纸、二甲苯、吸水纸等。四、实验方法(一) 细菌鞭毛染色1制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾
11、斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。2染色：涂片干燥后滴加A液染3-5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30-60秒钟。然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。3镜检：镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。注意点：染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况，即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c) 新鲜的染色液。（d）制片时不能加热固定（二）细菌运
12、动的观察1 压滴法(1) 制备菌液：从幼龄普通变形菌斜面上，挑数环菌放入装有1-2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。(2) 取2-3环稀释菌液于洁净载玻片个央，再加入一环0.01的美蓝水溶液，混匀。(3) 用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。(4) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。2 悬滴法(1) 取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。(2) 在盖玻片中央滴一小滴菌液(3) 将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片
13、中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。(4) 小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。(5) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。五、实验结果和报告1绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。2试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的？六、思考题 1制片时为什么不能加热固定？ 2没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？真实地记录你观察到的现象，并进行解释。3鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并
14、且要采用幼龄菌种?4根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?5试设计实验，如何鉴别某种细菌是否能运功，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。实验四 细菌的芽孢、荚膜染色一、实验目的1掌握细菌的芽孢染色法。2掌握细菌的荚膜染色法。二、实验材料1 枯草芽抱杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。2 二甲苯、香柏油、蒸馏水、5孔雀绿水溶液、0.5沙黄水溶液(或0.05碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95乙醇、石炭酸复红染液。3显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(1x6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。三、实验方法和步骤（一）芽孢染色法1方法1(1) 取3
15、7培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2) 于载片上滴入3-5滴5孔雀绿水溶液。(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5) 用05沙黄水溶液(或0.05碱性复红)复染1min，水洗。(6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。2 方法2(1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养18-24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。(2) 加5孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15-20min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染2-3min后，倾去染液，不用水
