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1、水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 1沉积物中多氯联苯类化合物分析规范1. 目标化合物20世纪70年代中期，美国在“清洁水法”中规定了129种优先污染物，其中包括6类PCB Aroclors，属于多氯联苯类化合物，本论文中研究的主要多氯联苯目标化合物则选择其中有代表性的12种同族物，它们分别是：PCB18、28、29、44、52、101、118、138、149、153、180、194（数字均为IUPAC编号）。2. 试剂、器皿和仪器2.1. 试剂二氯甲烷(Dichloromethane)，农残级（美国Fisher Scientific公司）；甲醇（Methanol），HPLC级（美
2、国Fisher Scientific公司）；正己烷（n-Hexane），农残级（美国Fisher Scientific公司）；Florisil（即佛罗里达硅土，120目），农残级（美国SIGMA）；中性氧化铝（50200目），（美国ACROS ORGANICS）；无水硫酸钠，优级纯，经450焙烧12 h后置于密封广口瓶中保存备用； 多氯联苯标准物质：12种多氯联苯同族物组成的混合标样，购自美国Supelco Co.；内标化合物（I.S.）：五氯硝基苯（PCNB），购自美国Supelco Co；回收率指示物(S.S.)：2，4，5，6-四氯间二甲苯（TMX）和十氯联苯（PCB209）购自美国Su
3、pelco Co；(Supelco Co.的材料由北京康林公司购买，业务电话：13911205919，010-64926155)。剪刀、滤纸、镊子及药匙（硅胶柱净化所用）：以二氯甲烷超声清洗15min两次、正己烷超声清洗15min一次；Florisil在4002C活化2 h（activate）；待冷却至室温时，称重后装入大口锥形瓶（250或500mL），加入其重量11%的蒸馏水去活性（deactivate），添加过程中应用滴管逐滴加入，边加边用力振摇以防止结块，并超声振荡30 min；放置过夜，平衡后加入正己烷浸没其表面备用（一般也需放置过夜），此时的Forisil呈现浅灰色。2.2. 仪器超
4、声波清洗仪(KQ250D型数控超声波清洗器)恒温水浴锅（中国科工卫仪器仪表公司）电子天平(精确到0.0001g，Sartorius AG.Co.,BS1005)冷冻干燥仪(FD-1冷冻干燥机，北京博医康公司）旋转旋蒸仪(Buchi, Vac 500/rotavapor R-200/Heating bath B-490,Germany)氮吹仪(数控氮吹仪，KL512/5093,康林,北京)蛇形索氏提取器(北京玻璃仪器公司，250 ml)气相色谱仪：HP6890-63Ni微池电子捕获检测器 (GC-ECD)(Agilent Technologies，美国)，使用Agilent ChemStatio
5、n for GC Systems分析处理数据；毛细色谱柱：HP-5石英毛细管色谱柱：30 m 0.32 mm ID 0.25 mm液膜厚不锈钢泥抓斗100级超净工作室；高纯氮气便携式保温箱不锈钢采样小盒玛瑙研钵及研杵2.3 玻璃仪器及其它用品专用玻仪：鸡心瓶、K.D浓缩器、8ml定量样品瓶，250ml分液漏斗，层析柱（长35cm，内径1 cm，带活塞）、GC自动进样的样品瓶。常规玻仪及其他用品：100ml、50ml、10ml量筒；200ml、100ml、50ml烧杯；500ml、50ml试剂瓶；胶头滴管、玻璃漏斗、玻璃棒；100ml、50ml三角瓶（带塞）；坩埚、药匙、5 ml移液管、微量进样
6、器、乳胶手套、布手套等。所用玻璃仪器均以10的稀硝酸浸泡过夜，再以重铬酸钾洗液润洗浸泡20min以上，分别用自来水、蒸馏水冲洗干净，在烘箱中110烘干；GC自动进样的样品瓶、标准样品瓶、层析柱必须用铬酸洗液浸泡一段时间后再认真冲洗干净烘干，并在400C高温烘烤2小时以上。3. 样品采集与保存现场捕捞生物样品(鱼等)放入溶剂淋洗过的不锈钢容器，并注明采样时间、采样地点、样品编号、样品名称、采样人姓名等。立即冷冻，放入便携式保温箱中带回实验室。样品运回实验室后保存于冰箱（4）中，密封保存(注意避光)，在存放样品时，应尽量注意存放在没有有机气体干扰的区域，以免交叉污染。所采样品在7天内前处理完毕，一
7、个月内分析完毕。4. 样品制备4.1. 制备冷冻的生物样品在室温下融化后，用干净的不锈钢小勺搅拌均匀，然后在冷冻干燥仪上冷冻干燥，干燥后的样品经研磨(研磨后过60目不锈钢筛)，准确称取25.00 g沉积物样品，加入回收率指示物TMX和PCB209(加入浓度根据当地污染程度确定，原则是与样品中目标污染物浓度相接近)，在平衡24小时后，用滤纸包裹(包裹要严实，避免泄漏)。冷冻的生物样品在室温下融化后，用干净的不锈钢小勺搅拌均匀，然后在冷冻干燥仪上冷冻干燥，干燥后的样品经研磨(研磨后过60目不锈钢筛)，准确称取5.00 g沉积物样品，加入回收率指示物TMX和PCB209(加入浓度根据当地污染程度确定
8、，原则是与样品中目标污染物浓度相接近)，用滤纸包裹(包裹要严实，避免泄漏)。4.2. 提取将包有样品的生物样品放入蛇形索氏提取器中，添加200ml二氯甲烷，在平底烧瓶中加入10片左右底铜片(1cm2)，放在水浴锅中，水浴锅温度控制在57-590C，回流速度控制在5-6次/h，连续抽提72hrs。在提取结束后，将蛇形管中的溶剂尽量完整的导入平底烧瓶中，作好编号。将包有样品的生物样品放入蛇形索氏提取器中，添加200ml丙酮：正己烷1：1试剂，在索氏提取器中加入10片左右底铜片(1cm2)，放在水浴锅中，水浴锅温度控制在57-590C，连续抽提24hrs。在提取结束后，将蛇形管中的溶剂尽量完整的导入
9、平底烧瓶中，作好编号。5. 样品净化5.1. 脱脂将提取液在旋转蒸发仪上(旋转过程中注意蒸发速度，温度390C,真空度500)，浓缩至约5 ml，使用15ml正己烷定量转移到50 ml鸡心瓶中，使用10 ml浓硫酸(分三次)脱脂（浓硫酸在底层，使用滴管将上清夜转移到另一鸡心瓶中）；继续浓缩至1ml左右，加入10ml正已烷，再次浓缩至1ml，完成溶剂替换。将提取液在旋转蒸发仪上(旋转过程中注意蒸发速度，温度390C,真空度500)，浓缩至约20 ml，使用5ml浓硫酸脱脂（浓硫酸在底层，使用滴管将上清夜转移到另一个比色管中，再使用5ml浓硫酸脱脂，上清液转移至另一鸡心瓶（250ml）中,；继续浓
10、缩至1ml左右，完成溶剂替换。上样时直接上样，再加2-3ml溶剂润洗，润洗液也上柱。5.2. 净化 采用Florisil层析柱净化。采用湿法装柱法，在干净的50cm长内径为10mm的层析柱上用记号笔在19cm处做上记号，取一个干净漏斗置于层析管顶端。先用10mL正己烷淋洗层析管，从下端排出至液面刚好浸没石英砂层，此淋洗液废弃。关上开关后，再加入20mL正己烷，用湿法装柱，用药匙将10 g Florisil从顶端漏斗加入（Florisil层的上界面在19cm的记号线位置）。注意在装柱过程中，要不断地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以适当的流速不断地流出，且保证正己烷液面始终高于柱界面（
11、即柱子不能断裂）；同时不断地用吸耳球轻轻敲打滴定管，使Florisil层紧密。最后以同样方法再在Florisil层上装入1cm的无水硫酸钠，用于样品脱水。调节正己烷液面，使其正好处于无水硫酸钠层面之上，关闭开关备用（注意此时管壁上不得粘有固体颗粒，否则需用正己烷冲洗干净再调节液面）。整个装柱过程中，正己烷可回收循环使用。将1mL待净化浓缩样品用滴管移入净化柱中，浸泡5 min以上，保证样品与净化柱充分接触交换。洗脱：以15mL正己烷分三次洗涤盛有二氯甲烷样品的K-D浓缩器，均用滴管移入净化柱中，然后以90滴/min左右的流速流出，并继续添加正己烷，使洗脱溶剂总体积为100mL，直至流干，洗脱液
12、用250mL平底烧瓶收集。 5.3. 待测样制备正己烷洗脱液继续浓缩至2 ml，加入内标(PCNB)，用柔和的氮气吹蒸定容至0.2 ml，作为仪器分析待测样。待测液定容后转移至GC自动进样用的样品瓶中，用压盖器密封后存放于冰箱中待测。净化采用Florisil层析柱净化。采用湿法装柱法，在干净的50cm长内径为10.5mm的层析柱上用记号笔在17cm处做上记号，取一个干净漏斗置于层析管顶端。先用10mL正己烷淋洗层析管，从下端排出至液面刚好浸没石英砂层，此淋洗液废弃。关上开关后，用湿法装柱，用药匙将10 g Florisil从顶端漏斗加入（Florisil层的上界面在17cm的记号线位置）。注意
13、在装柱过程中，要不断地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以适当的流速不断地流出，且保证正己烷液面始终高于柱界面（即柱子不能断裂）；同时不断地用吸耳球轻轻敲打滴定管，使Florisil层紧密。最后以同样方法再在Florisil层上装入1cm的无水硫酸钠，用于样品脱水。调节正己烷液面，使其正好处于无水硫酸钠层面之上，关闭开关备用（注意此时管壁上不得粘有固体颗粒，否则需用正己烷冲洗干净再调节液面）。整个装柱过程中，正己烷可回收循环使用。将1mL待净化浓缩样品用滴管移入净化柱中，浸泡5 min以上，保证样品与净化柱充分接触交换。洗脱：以15mL正己烷分三次洗涤盛有二氯甲烷样品的K-D浓缩器，均
14、用滴管移入净化柱中，然后以90滴/min左右的流速流出，并继续添加正己烷，使洗脱溶剂总体积为100mL，直至流干，洗脱液用250mL平底烧瓶收集。 5.4. 待测样制备收集液浓缩后转移至KD浓缩管，用柔和的氮气吹蒸定容至0.2 ml，作为仪器分析待测样。待测液定容后转移至GC自动进样用的样品瓶中，用压盖器密封后存放于冰箱中待测。6. 分析测定方法6.1. 色谱条件HP-5石英毛细管柱（30m0.32mm0.25m）；检测器放射源为63Ni；进样口温度：280；检测器温度：300；载气：高纯氮气，恒流2.5mL/min；无分流进样1L。升温程序为：始温60保留2 min，15/min升至180保
15、留10 min，再以4/min升至250。6.2. 定性与定量目标化合物定性利用多氯联苯混合标样6次平行分析的平均保留时间对照各色谱峰保留时间对实际样品中的农药进行定性(标准样品色谱图见图1)。样品中有机氯农药的含量用内标峰面积法定量。7. 质量保证与控制(QA/QC)体系7.1. 质量保证/质量控制目标：7.1.1. QA: Quality Assurance, 准确性、精密性、可比性7.1.2. QC: Quality Control, 较高的可靠性7.1.3. MDL:在99%以上的置信度，某物质可被可检出和报告的最低浓度。应至少分析3个以上的含预计方法限浓度3-5倍的目标化合物的搀混样
16、品获得MDL7.2. 质量保证/质量控制体系要求：7.2.1. 质量控制样品：空白样品，空白加标样，基质加标样，重复样(每20个测试样品同时完成一组质量控制样品的测试)。7.2.2. 目标化合物回收率：通过空白加标样品的测定，得到目标化合物的回收率。7.2.3. 仪器检测限(IDL)：测定空白样品(n=6)的5倍最小噪音(noise), 仪器检测限(IDL)等于3.36乘以5倍最小噪音的标准偏差(n=6),验证仪器状态。7.2.4. 方法检测限(MDL):基质加标样(n=6)测定，根据U.S.EPA方法检测限测定公式计算出本实验流程(方法)对各种目标化合物的检测限，判断本实验方法对实际样品中目标化合物检测数据的可信度。
