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1、1重组腺病毒载体介导人 DeltaNp73 转染对树突状细胞凋亡的抑制作用作者：胡义杰 范士志 蒋耀光 李志平 陈建明 何勇【摘要 】 目的： 研究人 DeltaNp73基因重组腺病毒转染人脐血来源树突状细胞（DC ）对其成熟状态及其凋亡水平的影响. 方法： 用 Adeasy系统构建人 DeltaNp73基因重组腺病毒；并通过增强离心法将其转染至人脐血来源 DC；流式细胞仪分析转染后 DC的成熟状态以及 DC的凋亡水平. 结果： 成功构建了人DeltaNp73基因重组腺病毒并高效转染 DC；人 DeltaNp73基因重组腺病毒转染提高了 DCCD83，HLADR 的表达，并能显著抑制其凋亡水平
2、. 结论： 人 DeltaNp73基因重组腺病毒转染 DC，促进 DC的成熟并抑制其凋亡，将有效地提高 DC疫苗的抗原呈递能力. 【关键词】 DeltaNp73 重组 遗传 腺病毒科 树突细胞 树突细胞疫苗0引言免疫治疗是肿瘤目前极有前景的治疗手段之一. 激活特异性细胞2毒性 T淋巴细胞（CTL）是实现肿瘤主动免疫治疗的关键. 树突状细胞(dendritic cell， DC)能摄取特异性相关抗原、高水平的表达与抗原递呈有关的 MHCI，MHC 分子、多种共刺激分子及黏附分子，从而激活初始 T淋巴细胞. 肿瘤细胞通过分泌一些免疫抑制因子来抑制 DC的成熟及其功能，甚至通过相关信号通路诱导 DC
3、细胞的凋亡1. 具有抑制细胞作用的 DeltaNp73属于 p53基因家族，其在肺癌组织中表达量和阳性表达率明显升高，是肺癌免疫治疗中较好的靶点. 我们拟通过构建 DeltaNp73的重组腺病毒（adenovirus, Ad）并转染人 DC，使 DeltaNp73在 DC内稳定高表达、呈递，并探讨 DeltaNp73高表达对 DC活化状态及凋亡水平的影响.1材料和方法1.1材料真核表达质粒 pcDNA3DeltaNp73HA由意大利罗马大学 Gerry Melino教授和 Vincenzo De laurenzi博士惠赠，含DeltaNp73基因 cDNA全长约 1700 bp. PAdTra
4、ckCMV，293T 细胞，E. coli BJ5183，DH5 大肠杆菌由第三军医大学西南医院烧伤研究所提供. KpnI， XbaI， PmeI， PacI限制性内切酶以及 T4DNA连接酶（NEB 公司） ；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒（Invitrogen 公司） ；大小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA PCR Kit（TaKaRa 公3司） ；人淋巴细胞分离液（B&D 公司） ；人白细胞介素 IL4，人粒 单核集落刺激因子 GMCSF，肿瘤坏死因子TNF（Perprotech 公司） ；AntiHA Tag Mouse monoclonal Ant
5、ibody（Applygen 公司） ；Tripure Reagent（百泰克生物公司）；MCCelLytics Mammalian Cell Protein Extraction Reagent，BCA 蛋白质定量测定试剂盒（上海申能博彩生物公司） ；goat antimouse IgG/HRP二抗（ Biosythesis公司） ；PEantiCD1a,PEantiCD83,PEantiHLADR及其同型对照（美国 BioLegend公司） ；PEAnnexin V凋亡试剂盒（晶美生物公司）. 根据 GenBank中 DeltaNp73 cDNA的序列，应用Primer 5软件设计针对其的
6、特异引物并由 Invitrogen公司合成.1.2方法1.2.1复制缺陷性腺病毒 AdDeltaNp73的构建复制缺陷性腺病毒 AdDeltaNp73含全长人 DeltaNp73 cDNA，由我科通过AdEasy系统构建. 50%组织培养转染剂量法（ TCID50）测得病毒的滴度（M.O.I）为 2.51011pfu/L.1.2.2人脐带血来源 DC的分离培养经产妇同意后，取剖腹产时新生儿脐带血（125103 U/L肝素抗凝） ，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心法2分离出单个核细胞， 37, 50 mL/L CO2孵箱4孵育. 2 h后转移未贴壁细胞至另一离心管供分离 T细胞，贴壁细胞更换含有细
7、胞因子 IL4（1000103 U/L） ，GMCSF（1000103 U/L）的培养基继续培养. 间隔 1 d半量更换培养基，补充细胞因子 IL4, GMCSF. 第 6日收获未成熟DC（immature dendritic cells, iDC） ；或者第 5日换液时加入TNF（50103 ng/L） ，刺激 48 h后即第 7日收获成熟DC（mature dendritic cells, mDC）.1.2.3重组腺病毒增强离心法转染 DC参照文献3 ，采用离心法增强腺病毒转染 DC.1.2.4转染后 DC中 DeltaNp73的表达收集 DC,腺病毒转染 48 h的 DC/AdDelta
8、Np73以及对照组的 DC/Adctrl. RTPCR分析 DeltaNp73 mRNA水平； Western Blot分析 DeltaNp73蛋白表达水平.1.2.5转染前后 DC表面标志物的变化收集 DC，PBS 洗涤细胞后，分别加入待检测的 CD1a，CD83 及 HLADR抗体及其同型对照；4避光孵育 30 min后，PBS 液洗涤 2次后上机检测.1.2.6DC凋亡水平的变化转染 7 d收集 DeltaNp73腺病毒感染的 DC（对照组采用正常培养 DC, AdEGFP转染的 DC） ；将细胞5悬浮在 1结合缓冲液中，调整密度为（2 5）108/L；将细胞悬液和 PE标记 Annex
9、in V混合，室温孵育 10 min；离心，PBS 洗涤细胞；使用 1结合缓冲液重悬细胞；PI 染色细胞（终浓度为1103 g/L） ，流式细胞仪分析 .统计学处理： 用 SPSS11.0软件分析数据；P0.05 为差异显著，P0.01 为差异非常显著 .2结果2.1DC的分离在诱导培养 DC过程中，第 5日在光镜下即可见细胞呈半悬浮生长，胞膜向外延伸出树枝状突起，CD1a+细胞约占29%. 加入 TNF刺激 48 h后其突起明显增多. 培养 7 d时表型检测 CD83细胞约占 91%，HLADR 表达约占 92%，均较各自未成熟组明显增多. 扫描电镜观察，胞质突起形成典型的树枝状，并可见 D
10、C的粗糙表面（图 1）.2.1重组腺病毒转染 DC以及 DeltaNp73的表达采用 200 M.O.I重组 DeltaNp73腺病毒有效转染 iDC（图 2）. 绝大部分细胞均出现绿色荧光的表达；最佳 M.O.I根据转染过后的效率以及对 DC的细胞毒性综合优化为 200（具体数据未列出）. RTPCR及Western Blot结果证实通过 200 M.O.I重组腺病毒转染 DC后，可6以观察到 DeltaNp73 mRNA及其蛋白在 DC中的表达（图 3）.2.3标志物的变化转染后的 DC表面分子 CD83，HLADR 均较iDC表达水平增加，接近 mDC水平（图 4）. CD83，HLAD
11、R 表达的上调在 AdDeltaNp73和 Adctrl组间没有差异，提示DeltaNp73对 DC表面分子的表达没有明显作用.2.4凋亡水平的改变重组腺病毒转染 DC 7 d后， DeltaNp73组 DC存活率显著高于另外两组；而正常培养 DC以及空腺病毒载体转染组之间没有显著差异. 同时，DeltaNp73 组 DCs的存活率达（71.02.8 ）% ，显著高于另两组；而正常培养 DC以及空腺病毒载体转染组之间没有显著差异（分别为（53.50.7）%， （45.53.5 ）%).3讨论DC是启动免疫反应最关键的抗原呈递细胞，但由于 DC具有高度不均质性，其分化以及功能很容易受外界因素的影
12、响；且恶性肿瘤可以通过分泌一系列的免疫抑制因子，致使 DC功能失调，从而系统的影响免疫抗瘤效应. 我们采用在体外诱导培养 DC，经含全长DeltaNp73基因重组腺病毒修饰，探讨 DC功能变化及进一步用于抗瘤的可行性.7首先，肿瘤可以干预 DC的成熟状态；而重组腺病毒转染可促进DC的活化. 从多种肿瘤患者肿瘤中分离的 DC，其共刺激分子CD80，CD86 等均低表达，即表型主要为未成熟表型，其 T细胞刺激能力明显减弱，体外诱导同源 CD4+ T细胞无力；是否诱导 T细胞的死亡4. 未成熟 DC对成熟刺激因子 GMCSF，TNF 或CD40L均呈低反应性，提示并非缺乏成熟刺激因子，可能是肿瘤相关
13、产物抑制了其成熟. 我们的实验结果显示 DeltaNp73对 DC的成熟并没有直接的影响，但重组腺病毒的转染，可以显著提高相关共刺激分子的表达，促进 DC的成熟；而 DeltaNp73的表达，却显著地诱导了 HLADR的表达，提示 DC高效表达 MHC I类和MHC II类分子，为下一步的有效抗原呈递提供了基础.其次，肿瘤患者体内易发生 DC的自发性凋亡以及 T细胞、肿瘤细胞介导的 DC凋亡 5 ；而 DeltaNp73重组腺病毒转染可抑制DC的凋亡，提高其生存率 . 相比于 iDC，mDC 更容易发生自发性凋亡6. DC与 CD4+ T细胞发生抗原特异性作用后，DC 立即进入凋亡过程；该过程
14、部分受 CD95CD95L（即 FasFasL）信号通路的调节. 已经证实 DC的生存期显著影响着在体 DC诱导 T细胞聚集增殖能力以及维持有效抑瘤免疫学效应的能力7. 通过 TNF受体修饰 DC，可以显著抑制 DC的自发性凋亡，使其生存期长于正常对照 DC以及空病毒载体转染的 DC8. 瘤内注射表达抗凋亡8分子 BCLXL的 DC疫苗可以诱导更强的抗瘤效应；并证实与 DC生存期延长相关9 . 本研究 DC的生存率明显高于正常对照 DC以及含 EGFP病毒转染的 DC，亦即 DeltaNp73可以抑制 DC细胞的自发性或诱导性凋亡，这将提高 DeltaNp73修饰 DC的 T细胞聚集增殖能力以
15、及有效抑瘤免疫反应能力.【参考文献】 1 Uramoto H, Sugio K, Oyama T, et al. Expression of the p53 family in lung cancer J. Anticancer Res，2006，26(3A):1785-1790.2 Morse HC, Kearney JF, Isaacson PG, et al. Cells of the marginal zoneorigins, function and neoplasia J. Leuk Res， 2001，25(2):169-178.3 Nishimura N, Nishioka Y
16、, Shinohara T, et al. Enhanced efficiency by centrifugal manipulation of adenovirusmediated interleukin 12 gene transduction into human monocytederived dendritic cells J . Hum Gene Ther， 2001，12(4):333-346.4 Munn D, Sharma M, Lee J. Potential regulatory 9function of human dendritic cells expressing indoleam
