《重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析 》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析 （13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析 【摘要】目的探讨重症肌无力（MG）肌肉中与收缩有关的肌球蛋白成分是否减少。方法 用 Gubstraub 溶液(myosin 提取液) 按常量（匀浆）和微量（浸出）方式提取 10 名正常人及 17例 MG 患者肌肉的蛋白成分，用双盲法分别以常量及微量聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析肌肉蛋白成分 , 用双向电泳分析有差异的谱带。结果常量 SDS-PAGE 电泳图谱分析显示,相对分子质量约 25 000 的蛋白谱带密度为 4.141.33，MG 患者肌肉为2.021.08，差异有非常显著意义（P0.001） ；微量分析获得正常肌肉该蛋白谱带的密度
2、为 4.262.58，MG 患者肌肉为1.340.79，差异亦有非常显著意义（P0.001） ；双向电泳显示，有差异的 25 000 蛋白略偏碱性，并至少由 2 个等电点相近的蛋白成分组成。用部分纯化的肌球蛋白鉴定显示，25 000 蛋白与肌球蛋白轻链无关。结论MG 患者肌肉中 25 000 蛋白水平明显低于正常人肌肉，提示该蛋白可能与 MG 发病或发展有关。 Analysis of protein components of skeletal muscle from the patients with myasthenia gravis 2【Abstract】 ObjectiveTo exp
3、lore whether the components of protein associated with muscle contraction appear decreased in the muscles of myasthenia gravis (MG).MethodsThe proteins were extracted from 10 normal cases and 17 cases of MG skeletal muscles with Gubstraub solution, and the components of the protein were analyzed by
4、SDS-PAGE in common and micro methods in double blind. Composition of the differential protein band was observed by two-dimensional electrophoresis.ResultsSDS-PAGE patterns showed that the density of the protein band with a mass of about 25 kD in MG muscles was much&nb sp;lower than that in normal mu
5、scles. The value of density for 25 kD protein band in common analysis was 4.141.33 and 2.021.08 in the normal and MG muscles, respectively (P0.001), while in micro analysis the density of the protein band was 4.262.58 in normal and 1.340.79 in MG muscles, respectively (P 0.001).The pattern of two-di
6、mensional electrophoresis demonstrated that the differential 25 kD protein band was composed of more than two components appearing in the adjacent isoelectric point on the alkaline side of the gel, and 3they were proved to be not related to the components of myosin light chains. ConclusionIt was sug
7、gested that pathogenically the development of MG should be associated with the involvement of 25 kD protein of the skeletal muscles. 【Key words】Myasthenia gravis； Muscle, skeletal； Proteins 重症肌无力（MG）被认为是一种由乙酰胆碱受体（AChR）抗体引起神经肌肉接头突触膜 AChR 功能丧失的自身免疫疾病。但近年已发现，一系列的非 AChR 骨骼肌抗体1 、Ryanodine 受体抗体及补体 C9 等均与
8、MG 的发病有关 2 。最近，我们不仅从肌肉组织中筛选到 5 个在正常人和 MG 患者肌肉中表达有明显不同的新的基因片段3 ，而且发现在以 PBS 提取的 MG 患者肌肉蛋白成分中，1 个相对分子质量约 25 000 的蛋白的水平明显低于正常人肌肉。由于 AChR 抗体阳性和阴性的 MG 患者临床表现相似，均为骨骼肌极易疲劳，并且已经知道 Duchenne 和强直性等肌营养不良的肌病患者骨骼肌肌球蛋白轻链组成发生了改变4 ，那么，是否MG 患者肌肉极易疲劳的唯一原因为 AChR 功能的丧失， 而不涉及肌肉蛋白，特别是与收缩有关的蛋白的变化呢？本研究就此问题进4行探讨。 资料和方法 1 样品来源
9、：正常人肌肉标本 10 份，取于 10 例骨折手术病人的肢体骨骼肌。MG 患者肌肉标 本 17 份，取于 17 例全身型MG 患者，无呼吸肌受累，其中 8 例伴胸腺瘤，9 例伴胸腺增生。肌肉取自 MG 患者胸腺切除手术切口周围的骨骼肌，标本均于-27保存。 2 蛋白的提取及浓度的测定：蛋白按常量及微量两种方法进行提取。常量提取：肌肉样品取米粒大小置微量玻璃匀浆器，加入 100 l 肌球蛋白提取液 Gubstraub 溶液(0.3 mol/L KCl，0.10 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4,pH 6.5)，冰浴下制成匀浆，吸出肌肉匀浆，加 50 l 提取液洗涤，合
10、并匀浆液并放置 4 过夜，10 000g 离心 15 min，上清液再经 25 000g 离心 10 min，按Spector5方法测定蛋白浓度。微量提取：将低温贮存的肌肉标本移至 4冰箱，放置片刻使其软化，取一小块肌肉置解剖镜下滴加含 20甘油的生理盐水，剥取肌纤维 10 根左右，放置 0.5 ml 5Ep 管底部，加入 10 l Gubstraub 溶液，4过夜，离心后吸取上清液，蛋白定量后冷冻保存。 3 肌球蛋白的部分纯化：基本按 Konagaya 等6方法进行。简言之，取正常人与 MG 患者肌肉各 1 块（约 10 mm3） ，按上述常量提取法获得蛋白上清液， 该上清液以 14 倍体积
11、的预冷无离子水稀释，混匀后 10 000g 离心 10 min，沉淀用 100 l Gubstraub 溶液溶解，再以 9 倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10 000g 离心 10 min，沉淀用 50 l Gubstraub 溶液溶解。 4 蛋白的单相电泳分析：基本按 Laemmli7 方法进行非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。制胶及电泳缓冲液均为含 0.1SDS 的 Tris/Gly, pH 8.3。常量电泳分析蛋白加样量均为 30 g,凝胶用考马斯亮蓝染色。微量电泳分析加样量均为 1 g, 蛋白检测基本按 Kirkeby 等8方法进行银染。 5 蛋白双向电泳分析：基本按
12、任惠民等9方法进行。第 1 向等电聚焦的胶长约 40 mm，直径 0.7 mm，凝胶浓度为5（含 4 pH 3.510.0 的 ampholyte, 5%甘油和 1尿素） 。6蛋白加样量为 30 g，凝胶上蛋白用银染显色。 6 蛋白分析及统计方法：将所需比较的蛋白谱带经生物电泳图像分析仪扫描并计算密度。检测结果以s 表示，两组间比较采用 t 检验。 结果 1 肌肉蛋白的微量和常量分析电泳图谱：图 1 左侧为常量提取的肌肉蛋白电泳图谱，图 1 右侧为微量提取的肌纤维蛋白经电泳分离的银染图谱。2 种方法分析的结果均显示，相对分子质量约25 000 蛋白谱带浓度在正常肌肉中明显高于 MG 肌肉。 2
13、 正常人肌肉与 MG 患者肌肉 25 000 蛋白水平的比较：常量电泳分析，25 000 蛋白谱带经扫描计算，密度在正常肌肉中为4.141.33， MG 肌肉中为 2.021.08, 差异有非常显著意义(P 0.001)。微量电泳分析，25 000 蛋白谱带密度在正常肌肉中为4.262.58, MG 肌肉中为 1.320.79,差异亦有非常显著意义7(P 0.001)。 3 蛋白的双向电泳图谱：图 2A 为正常人及 MG 患者肌肉蛋白的双向电泳图谱。从图 2A 可看出单相 SDS-PAGE 图谱所显示的 25 000 谱带至少由 2 个蛋白成分组成，正常肌肉与 MG 肌肉中有明显差异的是 1
14、个偏碱的蛋白成分。图 2B 为提取的肌肉蛋白与部分纯化的肌球蛋白提取物双向电泳图谱。可以看出，有差异的 25 000 蛋白与肌球蛋白提取物获得的蛋白成分无关。&nbs p;讨论 人们很早就对 MG 患者肌肉的形态学特征及与肌肉收缩有关的重要化学物质，如肌球蛋白、肌动蛋白等进行了研究。虽然发现MG 患者血清中抗肌球蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白等抗体滴度高于健康人10, 但迄今仍没有充分的证据说明 MG 患者肌细胞中调控肌纤维收缩的粗丝、细丝和 Z 带等形态学特征以及与肌肉收缩有关的蛋白合成发生了明显的改变，即使是在 MG 患者胸腺组织，也未发现肌样细胞(myoid cells)的数目和结构以及对肌球
15、蛋白、肌钙蛋白等抗体的染色反应与正常人有明显的差别11 。因此，目前8对 MG 的研究主要集中在对 AChR 的结构、抗体与抗原免疫学特征、应答 AChR 功能丧失的免疫学机制等方面。那么，MG 患者肌细胞内的化学物质，特别是 DNA 与蛋白是否真的没有发生改变呢？答案是否定的。 近年来，我们从肌肉中已经筛选到 5 个新的基因片段，并证实其中有 3 个基因在正常人与 MG 患者肌肉中的表达有明显的差异3 。最近我们用 SDS-PAGE 分析了 PBS 提取的正常人骨骼肌及MG 患者骨骼肌的蛋白成分，发现正常人肌肉中有一个相对分子质量约 25 000 的蛋白的水平明显高于 MG 患者肌肉。在本研
16、究中，我们改用肌球蛋白提取液 Gubstraub 溶液提取正常与 MG 患者肌肉的蛋白成分，亦发现 MG 患者肌肉中相对分子质量约 25 000 蛋白谱带水平明显低于正常肌肉，经扫描计算，该谱带密度在正常人肌肉与 MG 患者肌肉中的差异有非常显著意义（P0.001） 。双向电泳显示，该谱带是由数个等电点十分接近的蛋白成分构成（图2A） ，并且它们不是肌球蛋白的轻链成分（图 2B） 。 在过去的研究中，我们曾对正常及交叉神经支配的大鼠快、慢肌单纤维的肌球蛋白轻链特征进行过探讨。发现在正常大鼠中，快肌和慢肌的收缩速度和肌球蛋白轻链的数目是由快、慢肌本身决9定的，与肌纤维的 ATP 酶染色分型无关 12 。在交叉神经支配后，即快肌用慢肌神经支配，慢肌用快肌神经支配后，原先为快肌的肌球蛋白轻链类型随时程逐渐转变为慢肌的轻链类型；反之
