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1、色谱柱培训 1 前言 色谱柱是HPLC分离过程中的核心 一支稳定 高效的色谱柱对建立普适性强 重现性好的方法是必不可少的 不同供应商的色谱柱 甚至来源相同 认为完全一样的色谱柱之间 可能存在很大的差异 尤其是不同色谱柱在塔板数 色谱峰的对称性 保留值 峰间距及使用寿命会有所不同 而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大的影响 2 培训内容 介绍色谱柱担体 固定相以及柱填料信息讨论色谱柱使用过程中的问题及适宜的解决方案同时讨论在常规HPLC分析中 为获得最佳结果 一支 好 色谱柱的重要意义 3 色谱柱的结构 4 色谱柱与柱填料的特性 柱填料 大多数使用HPLC分离的色谱柱使用硅胶微粒作为担体
2、 少数为多孔聚合物担体或者其他材料的担体硅胶担体与键合的有机表层应用范围广 重点讨论常见的几种柱填料微粒 实心微球 全多孔微球 灌注微粒 5 6 7 实心微球型特点 实心核 起作用的是表面很薄的外壳 微粒的大小通常为1 5 2 5um 快速传质的动力学 对大分子有突出的分离效能 表面积较小 样品容量有限 仅适用于分析型HPLC 峰型尖锐 要求HPLC仪器的柱外峰展因素极小 避免峰展宽 8 灌注色谱柱填料 包含孔径达4000 8000 的贯穿孔 贯穿孔中有较小的内联孔 如300 1000 高流速时 对流与扩散作用共同作用 进入并离开孔结构 减小了峰展宽 柱效与小微粒相当 但压力降却小许多 使用范
3、围 大分子如蛋白质的制备分离 小分子较少 9 插入色谱柱的参数意义 ID 4 6mm颗粒 粒度 的大小在HPLC中极为重要 约5um的微粒直径很好的兼顾了分析柱的柱效 反压和寿命 更小的多孔微粒 如3um 对快速分离很有效 较窄的粒度分布 50 均值 能保证填充柱的稳定 高效和压力降最小 10 11 12 硅胶填充微粒 物理特性 机械强度很高 可保证填充柱长时间在很高的操作压力下工作 柱效稳定 使柱的反压较低 寿命较长 制作工艺 良好的控制制作工艺 能够得到平均孔径变化范围宽 如8 30 100um 孔径分布范围较窄和粒度选择较大 如10 5 3um 的填料 能满足大 小分子的分析和制备 13
4、 硅胶担体的表面性质极为理想 其表面可以通过化学改性引入种类繁多 具有不同官能团的键合相硅胶基质填料与水及所有有机溶剂兼容 更换溶剂时 填料大小不会变化 例如溶胀 这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以及使用梯度洗脱期间 仍保持稳定 14 硅胶担体并非完美无缺 在pH8 0以上条件下 硅胶能溶解 硅胶表面显酸性 不适宜于碱性物质的分离插入硅胶溶解曲线 15 硅羟基一般存在三种类型 16 自由或孤立 无氢键键合 的硅羟基一般产生于低浓度中 含自由 酸性硅羟基浓度高的硅胶往往使碱性物质的保留值增加 峰变宽 拖尾 完全羟基化的硅胶基质填料 具有高浓度成对的与缔合的硅羟基 最有利于碱性物质分离 查成对硅
5、羟基的酸性 17 硅胶担体的纯度对许多极性化合物的分离极为重要 某些硅胶被一定的金属污染 Al Fe Zn Ni等 这些金属杂质能与螯合溶质络合 引起不对称 拖尾色谱峰 甚至化合物被完全保留 不能洗出硅胶晶格中的其他金属 尤其是铝 能使表面硅胶硅羟基活性增强 酸性增强建议 采用色谱级试剂 18 19 硅胶分类 A型硅胶 过去纯度不高的硅胶 适用于分离中性和非电离的化合物B型硅胶 新型高纯度的弱酸性硅胶 一般对离子或可电离的化合物 尤其是碱性物质的分离较好B型硅胶的意义 见FDA批准的化药碱性药物表 20 21 22 23 多孔聚合物填料 优点 聚合物微粒有些是疏水性的 可直接用于反相 不需添加
6、表面涂层 在pH1 13均可用 很强的疏水保留性 相对于硅胶基质的C18柱 缺点 柱效低 一般不到类似的硅胶基质色谱柱的一半 在不同有机溶剂中溶胀程度不同 使用范围 非常适用于蛋白样品的分离 24 其他无机填料 石墨碳氧化铝 25 色谱柱的结构 不锈钢柱管 可用于所有的有机溶剂与大多数水性缓冲液 然而含氯的流动相会缓慢地 卤素腐蚀 不锈钢柱管 尤其是低pH条件下柱管不锈钢成分 铁 镍 铬 牢固络合的样品可能发生这类问题 但因为色谱柱内壁的表面积很小 发生不良反应的机会不大 26 多孔烧结物 滤片 封闭色谱柱的两端 固体色谱柱的填料一般来说 5um与3um的微粒分别用2um与0 5um孔径的不锈
7、钢滤片发生不良反应的可能比色谱柱内壁大得多峰型不好与样品回收率低可能预示滤片出现问题 27 压帽 即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽 中部有小孔 多为聚四氟乙烯制成 用于固定筛板 密封环 位于接头螺旋环内壁的弹性环 多为聚四氟乙烯制成 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封 28 接头 柱两端连接流动相与柱管的中空环套 由不锈钢制成 用于柱管路联通与柱端高压固定 封头 柱两端的密封螺丝 用于保存色谱柱时封头 柱填料 29 固定相 键合硅胶 在硅胶担体表面上共价键有机硅烷或沉积聚合物有机涂层使用最广泛的有机硅烷键填料的表面反应式见下图 30 31 32 结论 多官能团键合相与单官能团的键合相相比
8、 多官能团键合相在低pH条件下 它更稳定 但多官能团键合相的保留值与选择性却更不稳定单官能团硅烷反应的优点 重现性好 一个硅羟基与一个硅烷分子反应 产生可预测的结构 柱效最高 33 键合相配体的空间位阻效应 表面的硅羟基不能完全参与反应随链长或者硅烷体积的增大 参与反应的硅羟基比例相应的减少即使最小的硅烷 三甲基或C1 其表面上也有近50 的硅羟基未被反应 34 35 封尾 指键合填料与小硅烷进行后续反应 如三甲基氯硅烷 二甲基二氯硅烷等 反应掉残余的硅羟基 增加担体覆盖率 尽量减少与溶质发生不良反应 缺点 在低pH pH 3 反相分离中 极易从填料上水解 36 RPC中键合相的保留行为 键合
9、相填料的有机物含量 如百分含碳量 大致能说明一特定色谱柱的保留能力键合相担体的表面积是一主要因素 表面积越大 保留值k越大样品保留值一般随键合碳链长度而增加 C18 C8 C3 C1 但长链之间的差别并不大 即C8 C18 键合相可将样品的保留值控制在一定范围内 但随着填料的表面积与所用硅胶担体类型的改变而变化 柱间差异 37 键合相色谱柱的稳定性 相同情况下 长链的烷基键合相填料 如C8 C18 一般比短链的键合相更稳定 38 实例 39 结论 试验证明 长链的C18与C8配体明显更稳定 键合相流失引起的保留值变化不大 随着链长度的减小 固定相的稳定性也降低这是许多用户喜欢用他们的原因之一
10、40 硅胶基质键合相的稳定性 寿命 与硅胶担体和键合相的类型有直接的关系色谱柱稳定性也很大程度上取决于流动相的pH 所用缓冲液与有机溶剂的种类硅烷键合相的损失归咎于将硅烷键合于担体上的Si O Si键的水解 高温 低pH及水比例高的流动相中 离解加剧 而这些又是对许多样品分离较好的条件 41 改善硅烷固定相在低pH条件下稳定性的另一个方法 使用空间保护官能团 42 43 有空间保护的硅胶基质固定相的稳定性很高实例色谱条件 44 45 46 尽管大多数分离在低pH条件下进行最好 pH 3 但有些分离须在高pH条件下进行原因 有关化合物在低pH条件下不稳定在低pH条件下 达不到所需选择性质子化的
11、亲水的 碱性化合物子低pH条件下保留太小 47 柱填料封尾可以减少硅胶基质色谱柱在在中等与高pH条件下 硅胶担体溶解实例色谱条件 48 49 结论 小分子封尾硅烷在硅羟基加成反应产生了疏水层 有效延缓硅胶担体的溶解 50 建立pH7 0以上的普适性方法的策略 51 52 保留值与选择性变化的原因 硅胶担体不同硅烷的选择性 单官能团或多官能团键合的彻底性 部分反应或完全反应是否封尾键合化学担体表面积 53 任何情况下 在规定的色谱柱上建立的方法 都应该用至少两个其他批次柱进行证实后 才可采用 不同厂家的同种色谱柱很少得到相同的分离 迪马 菲罗门 安捷伦 54 55 色谱柱的性能指标 色谱柱的有关
12、要求 某指定k值的塔板数峰不对称因子As 或者拖尾因子 两种不同溶质的选择性 色谱柱的反压保留值k的重现性键合浓度色谱柱的稳定性 56 塔板数N 产生尖锐 窄谱峰 以及小 值时色谱峰达到良好分离度的能力 57 峰不对称与拖尾 峰不对称与拖尾能导致 塔板数与分离度测定不准定量不准分离度降低与峰尾中的小峰检不出保留值的重现性不好理想柱的色谱峰As值为0 92 1 1 绝对对称峰的As值为1 0 58 峰不对称性与拖尾因子的计算 59 60 色谱柱失效 色谱柱的寿命应有多长 如果塔板数下降50 或分离度约降至四分之三 则可能需要更换色谱柱 建议 建立色谱柱信息台账 对色谱柱的塔板数 拖尾因子 分离度
13、 柱压 保留值 进样时间进行登记 发现色谱柱可能失效 提前申报采购 记录最后一针的色谱信息即可 61 色谱柱问题与解决方案 保留值与分离度重现性不好的可能原因 62 解决有关重现性不好问题 通常有以下几点 在整个应用中都采用同一固定相 粒度和柱尺寸选择良好的流动相 尽量减小硅羟基效应确保流动相充分平衡色谱柱 63 谱峰拖尾 当出现拖尾峰时 估算柱塔板数与分离度是将偏高对于不对称因子为1 2的峰 峰拖尾因子约为1 5 用半高峰宽方法计算使塔板数偏高30 计算分离度的误差高达15 如果用中性化合物测试新柱 如显示峰严重不对称 不可用于方法建立 64 65 拖尾峰常见于使用过度的色谱柱 柱口赃物或塌
14、陷 部分堵塞进口滤板填补柱塌陷对价值较高的色谱柱最实用 手性柱 制备柱 在建立常规分析方法时 用保护柱可以减小强保留样品组分积聚可能性的有效方法注入的样品溶剂强度大于流动相时 往往会造成早流的色谱峰变形和拖尾 66 实例 67 并非适用于所有的情况 例如阿奇霉素肠溶干混对于难溶性的物质 可以先用强溶剂溶解后 再同流动相稀释 68 与HPLC设备有关的柱外效应可以引起峰拖尾与色谱峰变宽 进样体积过大进样阀 色谱柱及检测器之间的管线体积过大检测器流动池体积过大 69 实例 70 建议 进样体积要小 一般 25uL 进样阀与色谱柱 色谱柱与检测器之间用细内径的短连接管线 例如 20cm 内径为0 0
15、7cm 确保所有管线用匹配的接头正确连接使用易清洗 体积小的检测器流通池 8uL 71 色谱柱寿命 色谱柱失效的原因 进口滤片或柱床部分堵塞吸附有赃物柱填充不良机械及热冲击造成空洞担体或固定相遭化学侵蚀 72 色谱柱将失效的一些症状 柱压增高色谱峰拖尾塔板数下降选择性下降保留值减小 碱性化合物的保留值增大 73 色谱柱滤板问题 往往是部分堵塞滤片或色谱柱进口处的凹陷密封垫与转子磨损造成的微粒是堵塞滤片的主要来源 定期更换泵密封垫与进样阀转子一般能减少滤片的堵塞 74 温度对色谱柱寿命的影响 75 结论 当用磷酸盐缓冲液 以中等或高pH操作时 应小心使用超过40 的温度 76 强保留组分的样品组分严重拖尾峰的出现往往是强保留污染物在柱头进口处聚集的信号 77 保护柱 保护柱 填充良好 1 2cm 填料与分析柱相同优点 极端条件下可以提高色谱柱的稳定性 尤其是高pH及较脏 具有腐蚀性样品缺点 色谱柱总压升高不能检测分析柱的压力减慢了色谱柱的换相与平衡不适用于梯度洗脱结论 不建议全面的使用保护柱 用更稳定的色谱柱和侵蚀性不强的流动相 78
