《邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤 SOSP9607细胞作用及机理研究【摘要】目的:研究邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素（ ODE）抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理. 方法:采用 MTT 比色法测定体外抗骨肉瘤 SOSP9607细胞作用，透射电子显微镜观察细胞凋亡形态学；采用激光共聚焦显微镜测定 SOSP9607细胞内Ca2+ ,Mg2+,pH 值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度；免疫细胞化学技术检测细胞内 Bc12和 Bax 表达.结果:ODE 时间、浓度依赖性地抑制 SOSP9607细胞生长，诱导细胞凋亡具有典型的凋亡形态特征如细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂等；剂量依赖性地增加 SO
2、SP9607细胞内 Ca2+，Mg2+浓度而降低细胞内 pH值和线粒体膜电位；使 SOSP9607细胞内 Bcl2蛋白表达下降而Bax 蛋白表达增加.结论:邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤 SOSP9607细胞生长，其作用机制可能与改变细胞内环境稳态及 Bcl2和 Bax 蛋白表达而诱导细胞凋亡有关. 【关键词】邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素骨肉瘤肿瘤细胞凋亡线粒体膜电位 bcl2蛋白 Bax 蛋白 0 引言 骨肉瘤是起源于骨组织的最常见的恶性肿瘤，又称成骨肉瘤，任何年龄均可发病，而以 1525 岁青少年居多.是原发性恶性骨肿瘤中最常见，恶性程度最高的骨肿瘤，有早期发生远处转移(
3、易发生2肺转移)的特点，预后不良. 通常认为，骨肉瘤只要明确诊断，尚无肺转移，应施行高位截肢术或关节离断术，若合并单一肺转移源者可同时施行截肢术和肺转移源切除术.但是，骨肉瘤恶性程度高，截肢等破坏性手术后，生存机会从未超过 20%，且骨肉瘤截肢术后 80%以上患者均会出现肺转移1-3 ，基于这样的事实，目前骨肉瘤之治疗强调早期综合治疗.在早期综合治疗的措施中，由于骨肉瘤对放射治疗不敏感，仅用于手术前、后之辅助治疗，或肿瘤不能切除或肺转移时应用.所以骨肉瘤早期综合治疗措施以手术和化疗为主.这就促使了众多的学者寻找有效的抗骨肉瘤药物，试图通过化疗以期改善骨肉瘤患者的预后. 鬼臼是一传统的抗肿瘤中草
4、药，其衍生物 VP16，VM26 已成功用于临床，对多种肿瘤显示出良好的效果4-5 ，被认为是最有效、最有希望的抗骨肉瘤药物.但由于其溶解度差，生产工艺复杂，毒性高等原因限制了其广泛应用.新近发现鬼臼毒类衍生物有很强的抗氧化、清除自由基作用，此作用与其抗肿瘤作用相关6-7.因此，鬼臼成为最有希望研发高效低毒抗骨肉瘤新药的领域.据此我们将研究新鬼臼毒类衍生物邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤作用，并初步探讨其机理. 1 材料和方法 1.1 材料邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素由兰州大学化工学院田瑄教授惠赠，用 50g/LDMSO 溶解；RPMI1640 为 GIBCO 公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生
5、物有限公司产品，室温溶化后置 563水浴灭活 30min，无菌分装密封后置 -20冰箱冷冻保存备用；胰蛋白酶（Trypsin,Try）Difco1250，上海化学试剂站分装厂产品，用无 Ca2+，Mg2+的 DHanks配成 2.5g/L 溶液；四甲基偶氮唑盐3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT为 Sigma 公司产品，用 0.01mol/LPBS（pH 为 7.2）配成 5g/L（临时现配） ；十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)为 Sigma 公司产品，用0.01mol/L 盐酸配成
6、 100g/L 的酸化 SDS 溶液，室温保存备用；Fluo3/AM,MagFluo4/AM,CarboxySNARF1/AMandMitoTrackerGreenFM 探针为MolecularProbesCo.(Eugene,Oregon,USA)产品.鼠抗人 Bcl2单克隆抗体（Clone：Bcl2 ） ，鼠抗人 Bax 单克隆抗体（Clone：2D2 ）为 Zymedlabortrory 产品，均 1100稀释.HistostainPlusKit(抗小鼠免疫组化试剂盒，LHK611)为晶美公司产品. 1.2 方法 1.2.1 细胞株及培养成骨肉瘤 SOSP9607细胞株由第四军医大学唐都
7、医院全军骨肿瘤研究所实验室引进.细胞株用含体积分数为 100mL/L 的小牛血清、2mmol/LL 谷氨酰胺（LGln ）,1105U/L 青霉素和 100mg/L 链霉素的 RPMI1640 完全培养液，在 37，50mL/LCO2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养.传代时先用2.5g/L 胰蛋白酶（ Try）消化 24min，倾弃 Try，再用培养液将细4胞吹打制成单细胞悬液传代，每 23d 传代一次，取对数生长期细胞用于实验. 1.2.2 邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素对 SOSP9607细胞生长的抑制作用取对数生长期 SOSP9607细胞并制成 2108 细胞/L 单细胞悬液，每孔 90L接种于
8、 96 孔培养板，实验组分别加入不同浓度的 ODE（终浓度 6.25200mg/L） ，对照组加入等量溶媒（终浓度 5g/LDMSO） ，调零孔加不含细胞的完全培养液 100L，每组设四个复孔.在 37，50mL/LCO2 及饱和湿度的培养箱中培养，培养结束前 4h 每孔加入 5g/LMTT10L，继续培养 4h 后每孔加入细胞裂解液 100g/LSDS100L终止反应，过夜，振荡摇匀后，全自动酶联免疫检测仪（ELx800 型，美国 BioTEK产品）测定各孔在570nm 波长的 A 值，读取 4 孔 A 值并求其平均值，并计算药物对肿瘤细胞的抑制率.细胞抑制率（IR% ）=（1-A 药物组/
9、A 对照组）100% 1.2.3 透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscopy，TEM ）检测 SOSP9607细胞凋亡形态学变化将对数生长期 SOSP9607细胞以 1108/L 的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度 ODE，对照组加入等量溶媒（终浓度 5g/LDMSO） ，培养 24h 后，收集细胞，PBS 液洗 3 次，弃上清液，用 30g/L 戊二醛固定液连续固定 2 次，每次 30min，10g/L锇酸 4固定 2h，然后分别用 500,700,90mL/L 的丙酮各脱水15min，1000mL/L 丙酮脱水 45min.浸入 11丙酮包埋剂混合液，5置室
10、温下 1h.浸入包埋剂 37过夜.60固化 48h，降温后保存于干燥器内.钻石刀将选定区域修成电镜切片团块，超薄切片机切片后贴于铜网上进行观察. 1.2.4 激光共聚焦显微镜测定 SOSP9607细胞内Ca2+ ,Mg2+,pH 值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度SOSP9607细胞以 2108/L 的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒，每组 3 瓶，培养 24h 后，用 2.5g/L胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，PBS 液洗涤 3 次，每瓶细胞分为 4份，根据分子探针说明书在 37避光条件下分别应用Fluo3/AM(5mol/L),Magfluo4(5mmol/L),C
11、arboxySNARF1/AM(10mol/L)和 MitoTrackerGreenFM(1.25mol/L)负载细胞，孵育 45min 后用 PBS 液洗涤 23 次，制备细胞悬液滴片，用激光共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+ ,Mg2+ ， H+ 和 MMP 荧光强度. 1.2.5 免疫细胞化学方法（Immunohistochemistry,IHC）观测 SOSP9607细胞内 Bcl2,Bax蛋白表达变化将对数生长期SOSP9607细胞以 1108/L 的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒（终浓度 5g/LDMSO） ，培养 24h 后，收集细胞，预冷 PBS 液洗 3
12、 次，涂片，立即风干，冷丙酮饱和湿度固定，PBS 漂洗，加 30mL/LH2O2甲醇液以消除内源性过氧化氢酶的作用，PBS 漂洗，加试剂 A(山羊血清), 室温饱和湿度孵育10min，弃去山羊血清，加 100L适量一抗，4饱和湿度过夜孵6育，PBS 漂洗，加试剂 B(抗小鼠生物素化二抗)，室温饱和湿度孵育10min，PBS 漂洗，加试剂 C（HRP 标记链亲和素） ，室温饱和湿度孵育 10min，PBS 漂洗，加 DAB 显色液室温显色（时间以镜下观察为准） ，自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检（阳性部位应显棕黄或棕褐色）. 统计学处理：实验
13、结果用 xs 表示.组间比较用方差分析及Dunnettt检验,P0.05 为有统计学意义. 2 结果 2.1 邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素对 SOSP9607细胞生长的抑制作用 MTT 比色法检测结果（表 1）显示邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素对 SOSP9607细胞生长有明显的抑制作用，邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素作用 24h 抑制 SOSP9607细胞生长的最低有效量为25mg/L，抑制率为 14.8%，抑制作用随浓度的增加而增加，200mg/L 的抑制率为 45.0%；作用 48h 时抑制作用进一步增强，最低有效量为 6.25mg/L，6.25200mg/LODE 对 SOSP9607细胞生长的抑制率
14、依次为 15.4%，25.9%，36.4%，49.9%，61.9%和 74.7%，IC50 为 50.0mg/L，说明 ODE 能时间、浓度依赖性地抑制 SOSP9607细胞生长. 表 1ODE 抗骨肉瘤 SOSP9607细胞作用（略） aP0.05,bP0.01vs 对照. 2.2 邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素对 SOSP9607细胞凋亡形态7学的影响与对照组比较，实验组 SOSP9607细胞出现明显的凋亡形态学变化：细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂及空泡等（图 1）. 2.3 邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素对 SOSP9607细胞内Ca2+ ， Mg2+ ，pH 值和线粒体膜电位的影响 ODE
15、剂量依赖性的增加 SOSP9607细胞内 Ca2+浓度， 200mg/L 时较空白对照增加 3.16 倍.同时，ODE 也剂量依赖性的增加 SOSP9607细胞内Mg2+浓度(表 2). ODE 能剂量依赖性的降低 SOSP9607细胞内 pH 值，以100mg/L 作用最为明显，抑制率为 64.1%；同样，ODE 也剂量依赖性的降低 SOSP9607细胞线粒体膜电位，200mg/L 的作用最为明显，抑制率为 40.2%. A:对照 ;B:ODE50mg/L. 图 1ODE 对骨肉瘤 SOSP9607细胞凋亡特征的影响6000（略） 表 2ODE 对骨肉瘤 SOSP9607细胞内 Ca2+,M
16、g2+浓度,pH 值和 MMP 的影响（略） aP0.05,bP0.01vs 对照. 2.4 邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素对 SOSP9607细胞内Bcl2，Bax 蛋白表达的影响与对照组比较，ODE 浓度为 50mg/L时,Bax 蛋白表达增多,而 Bcl2蛋白表达下降（图 2）. 3 讨论 8鬼臼毒素类药物如 VP16 等是典型的细胞凋亡诱导剂，我们也发现邻 氨基酚去甲表鬼臼毒素能诱导骨肉瘤 OS9901细胞凋亡.一般认为，细胞内离子稳态的紊乱是细胞凋亡或死亡的最主要原因，也是大多数化疗药物作用的结果.Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和信号转导等机制的第二信使之一8.目前，Mg2+对细胞凋亡的影响尤其引人注目，
