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1、1还原型谷胱甘肽抗白血病免疫佐剂作用实验研究作者：潘敬新，林玲，郭健欣，朱元贵，蔡俊峰，郭熙哲，陈志哲【摘要 】 本研究探讨还原型谷胱甘肽（ GSH）逆转反应性氧代谢物（ROM）对 NK 细胞抗白血病效应的抑制作用。在 K562 细胞、NK 细胞的混合培养体系中分别加入富含单核细胞的单个核细胞（Mo ）和白细胞介素-2（IL-2 ） ，观察 ROM 产量和 K562 细胞抑制率，然后分别加入 GSH 或二氢氯化物组胺（组胺） ，观察 ROM产量及 K562 细胞抑制率的变化。结果表明：加入 IL-2 后，ROM的产量从 33.1725.02 U/L 增至 223.5959.41 U/L（P0.
2、01） ，K562 细胞抑制率从 65.56%升至 85.89% (P0.01)；在加入E/Mo=10/1、10/5、10/10 3 种浓度的 Mo 后，ROM 产量分别为389.7943.83 U/L，456.7442.77 U/L，601.4221.92 U/L，K562 细胞抑制率分别为 82.36%，81.36%，48.09%，加入组胺或 GSH 后，E/Mo=10/2 时，ROM 产量从 389.7943.83 U/L，分别减至 50.2122.4 U/L 和-3.589.49 U/L（P0.05 ） ，随着 GSH 或组胺浓度的增加 ROM 产量逐减少，K562 细胞抑制率从 82
3、.53%分别升至 94.64%和 96.39（P0.05） ，ROM 产量与K562 细胞抑制呈负相关（P0.05） 。结论： 当 E/Mo=10/2 时，GSH 逆转ROM 强于组胺，提高 NK 细胞对 K562 的抑制率与组胺相似，但毒副作用轻微，GSH 可能成为更理想的抗白血病的免疫佐剂。 【关键词】 白血病Effect of Reduced Glutathione as Anti-leukemic Immune AdjuvantAbstract To investigate the reversal effect of reduced glutathione(GSH) on suppr
4、ession of NK cells by reactive oxygen metabolites (ROM) in K562 cells，interleukin-2 (IL-2) or mononuclear cell (Mo) was added in cultured cell line of K562 cells and NK cells，the yield of ROM and K562 cell suppression rate were observed.Then the histamine dihydrochloride (DHT) or GSH was added in th
5、e mixed cultured cell lines，the ROM production and K562 cell suppression rate were observed. The results showed that the ROM yield increased from 33.175.08 U/L to 223.599.41 U/L by IL-2，and K562 cell suppression rate increased from 65.56% to 85.89% by IL-2 (P0.01).The ROM yields were 389.7943.83 U/m
6、l， 456.7442.77 U/ml and 601.4221.92 3U/ml respectively， and K562 cell suppression rates were 82.36%， 81.36% and 48.09% respectively，when Mo was added in the mixed cultured cell lines under ratios of E/Mo being 10/2，10/5 and 10/10.When E/Mo was 10/2，DHT or GSH was added in the mixed cultured cell lin
7、e ROM yield decreased from 389.793.83 U/L to 50.212.4 U/L or-3.589.49 U/L (P0.05) respectively.With increase of concentration of DHT or GSH，the ROM yield in the mixed cultured cell line decreased (P0.05)，the K562 cell suppression rate increased from 82.53% to 94.64% or 96.39% (P0.05)，the more ROM yi
8、eld，the less K562 suppression rate (P0.05).When E/Mo is 10/5 or 10/10，the ROM yield decreased by the high concentration of DHT or GSH (P0.05)，but the K562 cell suppression rate not increased by every concentration of DHT or GSH.GSH was as effective as DHT in the reversing ROM and increasing K562 cel
9、l suppression rate.It is concluded that GSH may reverse ROM and increase K562 cell suppression rate，and GSH is as effective as DHT，but GSH has less side-effect than DHT.Therefore，GSH would be better antileukemia immune adjuvant.4Key words glutathione; leukemia; immune adjuvant; reactive oxygen metab
10、olite; NK cell人们很早就发现，肿瘤组织内及其周围存在着大量 T/NK 细胞。与机体其他部位相比，肿瘤及其周围组织中的 T/NK 细胞功能显著降低1 。当今，常以 T/NK 细胞为效应细胞，以 IL-2 为刺激剂作为肿瘤的过继性免疫治疗的手段，但对大部分病人疗效不佳，其原因是肿瘤及其周围组织内也存在大量富含单核/巨噬细胞的单个核细胞 (Mo)。 Mo 对荷瘤动物淋巴细胞抗肿瘤作用有抑制效应，这种抑制作用与 Mo 分泌反应性氧代谢物（reactive oxygen metabolites，ROM ）密切相关2 。二氢氯化物组胺（简称组胺）可以逆转 ROM 对 T/NK 抗肿瘤活性抑制
11、作用，并且已做 II 期临床试验，效果明显1 ，但其毒副作用大，临床难于应用。为了寻求高效低毒、便于临床应用的 ROM 逆转剂，我们进行了还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）在体外白血病细胞株培养体系中逆转ROM、增强 NK 细胞杀伤 K562 细胞的实验研究，现将结果报道如下。材料和方法材料5K562 细胞株由福建医科大学附属协和医院老年病研究所朱元贵博士惠赠，新鲜健康人单的采白细胞由泉州市中心血站提供，IL-2 为北京双鹭药业公司产品，二氢氯化物组胺、GSH 和 MTT 均为 Sigma 公司产品，CD3、CD56 免疫组织化学试剂盒为北京中山公司产品，活性氧测试剂盒为南京建成
12、公司产品。方法富含 NK 细胞的单个核细胞（E）的分离 采用 Percoll 不连续密度梯度分离法2分离，采用免疫组织化学法进行鉴定 3 ，其纯度达 30%，活存率95%。富含单核细胞的单个核细胞（Mo)的分离 采用 Colotta 方法2分离并作非特异性酯酶染色鉴定纯度，4 冷藏备用，其纯度为 70%，活存率95%。细胞培养及检测将富含 NK 细胞的单个核细胞(E)、K562 细胞(T)按 E/T 比101、105、1010 3 个比例加入相应的 96 孔培养板中（NK细胞为 105/孔） ，肿瘤组织中淋巴细胞与单核细胞的比例在文献中未见报道，我们观察 30 份恶性肿瘤的病理切片及慢性髓细胞
13、白血6病的骨髓涂片，其比例多数在 101 至 103，少数高达 1010，因此，在 E/T 为 101 的比例孔中按 E/Mo 细胞为102、105、1010 比例添加单核细胞，以仅加 K562 细胞、NK 细胞、Mo、NK 细胞+Mo、Mo+K562 细胞及不加任何细胞的全空白作为对照，混合培养 6 小时检测 ROM 产量，同时在 24 小时用 MTT 法4 检测 K562 细胞抑制率(K562 cell inhibition rate，KIR)，计算公式为 KIR=（1-ODE/T-DDE/ODT ）100% 。每组每种检测各作 3 个复孔，观察 ROM 产量与 KIR、NK 细胞数量、M
14、o 数量之间的关系。GSH 作用的测定以二氢氯化物组胺为阳性对照，以 K562+NK+Mo+IL-2 为空白对照，检测 GSH 逆转 ROM 及提高 K562 细胞抑制率的作用。按上述细胞比例先分别入 NK 细胞、单核细胞、 IL-2（150 U/ml） (方法根据文献5 )，同时在各个比例孔中分别加组胺（ 10、20和 50 umol/L 3 种浓度） ，GSH（25、50、100 和 250 mol/L 4种浓度） ，在 37、5% CO2、饱和湿度条件下共培养 24 小时后加入 K562 细胞（按 E/T 比为 10/1） ，再培养 6 小时及 24 小时，检测ROM 产量，同时用 MT
15、T 法检测 K562 细胞抑制率，KIR=（1-ODE/T-ODE/ODT）100% ；同样每组每种检测各做 3 个复孔4 。7ROM 检测采用紫外分光光度比色法、按南京建成活性氧测试盒说明操作，检测活性氧的产量。K562 细胞抑制率 采用 MTT 法检测（公式见上） 。统计学分析采用 SPSS 11.0 统计软件进行统计分析。计量资料结果以xSD 表示，多组均数比较采用广义线性模型（general linear model） ，各实验组均数间多重比较采用 LSD-t 检验（方差齐）或Dunnett T3 检验（方差不齐时） ，双变量相关分析采用 Pearson 相关分析。以 P0.05 作为差异显著性检验水平。结 果GSH 对 ROM 产量及 NK 细胞抑制 K562 的影响当 E/Mo=10/2 时，各种浓度 GSH 和组胺均可明显降低ROM 产量，提高 K562 细胞抑制率（P0.05） ，逆转 ROM 作用8GSH 强于组胺；当 E/Mo=10/5 时，各浓度组胺和高浓度 GSH 可减少 ROM 产量（P0.05 ） ，但不能提高 K562 细胞抑制率；当E/Mo=10/10，仅高浓度的组胺和高浓度 GSH 可减少 ROM 产量（P0.05） （表 1） 。Table 1.Effect of GSH on ROM yield
