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1、生物技术制药,药品生产技术专业,项目二细胞工程制药技术,教学目标,知识目标了解细胞工程制药技术的基本概念熟悉细胞工程制药技术的基本原理及其应用掌握细胞培养和融合的基本技术，掌握杂交瘤技术。技能目标学会细胞工程制药的基本技术和基本操作技能能运用植物细胞培养技术等研究、生产和开发药物的相关参数，并能编制典型的细胞工程制药技术药物的工艺方案。,紫杉醇的生产,紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植物中分离得到的一种双萜类化合物化。C47H51NO14， 分子量：853.90用途：具有良好的抗癌活性，尤其对晚期、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分显著的疗效。制备途径：1.直接从红豆杉中提取2.化学全合成；化学
2、半合成3.植物细胞培养4.内生真菌培养,提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量为0.005% 左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。无法满足市场需求，破坏宝贵资源、不可持续发展。,化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得率,仅4-5%。成本高。,有效途径：红豆杉细胞培养制备紫杉醇,1.从树叶获取细胞，利于资源保护（红豆杉属于濒危保护植物）2.细胞培养不受地理环境影响：地理环境、病虫害和季节等因素的影
3、响，可以保证产物无限、连续、均匀地生产。3.利用生物技术提高目标产物含量，实现大规模培养制备。（1）可以通过进行红豆杉细胞的筛选，获得超过原植株紫杉醇含量的细胞。（2）易于在生物反应器中满足最佳条件，进行大规模、高密度地培养。（3）可以进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径研究，利用代谢调控使细胞定向合成有用次生代谢物。,紫草素：为植物色素之一种（萘醌）。存在紫草植物中。抗癌、抗炎、抗菌等。日本在1983年用大规模紫草细胞培养来生产紫草素。,灵芝酸：是灵芝中除多糖外另一类具有广泛生理活性的物质,被证明具有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、抗肿瘤等活性。,人参皂苷：对人体神经系统、循环系统、血液系统
4、等具有广泛的生物活性。,什么是细胞工程技术,主要是通过细胞融合、核质移植、染色体或基因转移以及组织培养和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的细胞及其产品的生物工程技术。,一、细胞和细胞培养技术,（一）细胞的生物学基础,生理学特性比较,细胞全能性是指细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。在多细胞生物中每个个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，在一定条件下，都可以发展成多功能APSC多能细胞，而且只要条件许可，每个个体细胞的细胞核都可发育成完整的个体。,细胞全能性,原因：细胞具有全套遗传物质,条件：离体，适宜的营养和植物激素,植物细胞工程,植物组织培养,植物体细胞杂交,动物
5、细胞培养,单克隆抗体生产技术,（二）植物细胞培养技术,植物细胞培养是在离体条件下培养植物细胞的方法。,愈伤组织,易分散的组织,液体培养基中,震荡培养,继代培养使细胞增殖,悬浮细胞,细胞群体,1.植物细胞培养的基本过程,步骤1 灭菌消毒（无菌术）,采用次亚氯酸盐的稀溶液、福尔马林、酒精灯消毒剂对植物体或种子进行灭菌消毒,步骤2 形成愈伤组织,愈伤组织原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。,外植体的选择与灭菌 植株茎的切段、叶、根、花和种子，或把其中的某些组织切成片或块状等均可作为外植体。植物生长调节物质 通常情况下，
6、诱导愈伤组织的培养基中都含有较高浓度的生长素(如2,4-D)和较低浓度的细胞分裂素(如6-BA)。愈伤组织诱导成败的关键主要受外植体的类型及培养基组成，特别是激素的种类和浓度水平的影响。,植物愈伤组织的形成结构,根据愈伤组织的性质和细胞组成的特点，可以将它们的结构分为致密和松散两种类型。,致密型,松散型,愈伤组织形成的过程,外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为四个时期，即诱导期、分裂期、形成期和分化期。,愈伤组织的继代培养,愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，即继代培
7、养。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。,步骤3 摇瓶培养-大量悬浮培养,2.植物细胞培养基的组成,3.植物细胞培养的方法,3.1单倍体细胞培养在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。,单细胞的分离,从外植体中直接分离单细胞从愈伤组织中分离单细胞通过原生质体再生法获取单细胞,* 叶片是分离单细胞的最好材料 *,机械法：第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：叶片研碎、离心 酶解法：,机械法第一种方法： 用刀片刮叶片,机械法第二种方法：叶片研碎、离心,酶解法,Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,从愈伤组织中分离单细胞 将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团伙单细胞，然后用适当孔径的细胞筛过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。,通过原生质体再生法获取单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团通过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁得到原生质体。,单细胞培养培养方法,液体浅层培养法固体平板培养法看护培养法微室培养法,
